一種基于磁珠與多糖水解分離發(fā)光標(biāo)記物的核酸檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生化檢測(cè)和分子診斷領(lǐng)域，尤其涉及一種基于磁珠與多糖水解分離發(fā)光標(biāo)記物的核酸檢測(cè)方法。本發(fā)明可應(yīng)用于涉及超靈敏核酸分子檢測(cè)的領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，由于惡性公共衛(wèi)生事件頻發(fā)，如1996年日本發(fā)生的大腸桿菌(E.coli)0157:H7食物中毒的暴發(fā)流行，引起數(shù)人死亡，超過(guò)萬(wàn)人感染，造成巨大的社會(huì)恐慌；2003年SARS病毒在我國(guó)的肆虐；2005年豬鏈球菌的危害；近來(lái)禽流感病毒及2009年全世界范圍內(nèi)流行的甲型HlNl流感病毒等，都對(duì)人們的健康和生命造成了嚴(yán)重的威脅。另外，致病微生物污染也是影響我國(guó)食品衛(wèi)生和安全的最主要因素，微生物性食物中毒導(dǎo)致的中毒人數(shù)最多，在2003年和2004年全國(guó)報(bào)告的重大食物中毒事故中，微生物性重大食物中毒起數(shù)和人數(shù)均有增加，分別占當(dāng)年總起數(shù)和總?cè)藬?shù)的26%、43.8%和34%、58.1 %。食品在加工、運(yùn)輸、貯藏、銷售等過(guò)程中極易受到致病微生物污染。有害致病微生物不僅影響人們的健康，危及人們的生命，而且引起全社會(huì)的恐慌，影響正常的社會(huì)運(yùn)行。為了能快速準(zhǔn)確地鑒定病原體，力求將病原體對(duì)人的危害降到最低，科學(xué)家們使用了很多種鑒定方法。傳統(tǒng)的微生物特征信息檢測(cè)方法有病原體的培養(yǎng)、生化分析、毒素測(cè)定、血清學(xué)(抗原或抗體)檢測(cè)等，但這些檢測(cè)方法不僅不適合快速偵檢，而且難以檢測(cè)和鑒定病原體中所含的多種信息，如致病基因、毒力基因、抗性基因等。雖然近年來(lái)也發(fā)展了 PCR技術(shù)及核酸探針雜交技術(shù)，但不能對(duì)微生物特征信息進(jìn)行快速檢測(cè)、更不具備高通量篩查的能力。
[0003]惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一。世界衛(wèi)生組織和國(guó)際抗癌聯(lián)盟的相關(guān)資料顯示，如果不能有效控制惡性腫瘤的發(fā)病率，預(yù)計(jì)癌癥發(fā)病例在2020年將達(dá)到1600萬(wàn)，近1000萬(wàn)人死亡。我國(guó)每年新增癌癥患者約160萬(wàn)人，其中因癌癥死亡人數(shù)約130萬(wàn)人。導(dǎo)致癌癥患者死亡主要是因?yàn)闊o(wú)法及早發(fā)現(xiàn)從而貽誤治療時(shí)機(jī)以及腫瘤治愈率低，而早期發(fā)現(xiàn)與有效治療是預(yù)防和治療癌癥的關(guān)鍵手段。幾十年來(lái)，研宄者們發(fā)現(xiàn)，生物標(biāo)志物可以用來(lái)進(jìn)行腫瘤早期診斷，使得癌癥的治愈率、生存率大大提高。近年來(lái)，隨著微小RNA(microRNA, miRNA)的發(fā)現(xiàn)和進(jìn)一步研宄，使其有可能作為新的生物標(biāo)志物。已證實(shí)，miRNA在外周血中的表達(dá)具有腫瘤相關(guān)性、組織特異性以及表達(dá)穩(wěn)定性，外周血miRNA很可能是一種理想的腫瘤標(biāo)志物，為癌癥的早期診斷開(kāi)辟了新途徑。目前，外周血miRNA的檢測(cè)手段主要有miRNA芯片技術(shù)與實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)。但二維的芯片技術(shù)使得核酸雜交效率低下，使得其檢測(cè)靈敏度相對(duì)偏低。而熒光定量PCR檢測(cè)miRNA需要設(shè)計(jì)復(fù)雜的莖環(huán)探針，以及進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，使得其檢測(cè)成較高，亦無(wú)法實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。
[0004]隨著納米技術(shù)的迅速發(fā)展，納米材料逐漸被應(yīng)用到生命科學(xué)領(lǐng)域，納米磁珠(magnetic beads, MBs)因具有分離速度快、效率高、可重復(fù)使用、操作簡(jiǎn)單、易功能化、易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化以及不影響分離物質(zhì)的活性等特殊的物理化學(xué)性質(zhì)和生物相容性，目前已應(yīng)用于細(xì)胞分離、免疫測(cè)定、蛋白質(zhì)和酶的固定以及核酸檢測(cè)等方面。
[0005]近年來(lái)，發(fā)光標(biāo)記類檢測(cè)方法，如熒光標(biāo)記、酶標(biāo)化學(xué)發(fā)光等已廣泛應(yīng)用于生物分子檢測(cè)來(lái)放大檢測(cè)信號(hào)以提高檢測(cè)靈敏度。操作安全，方法簡(jiǎn)便、快速，具有巨大的潛力，正成為生物分析研宄與發(fā)展的最重要領(lǐng)域。因此，結(jié)合核酸探針雜交技術(shù)，通過(guò)標(biāo)記能夠產(chǎn)生發(fā)光信號(hào)的分子而獲取靶核酸信息，可實(shí)現(xiàn)靶核酸的快速檢測(cè)與高通量篩查。
[0006]目前，已報(bào)道各種基于固相雜交與發(fā)光標(biāo)記的核酸檢測(cè)方法。其基本思路為:在固相載體表面修飾核酸探針，通過(guò)捕獲標(biāo)記有發(fā)光信號(hào)分子的待測(cè)特異核酸片段，再檢測(cè)發(fā)光信號(hào)，經(jīng)分析后，即可快速確認(rèn)靶核酸的特性。
[0007]但隨著研宄深入發(fā)現(xiàn)，影響基于磁珠與發(fā)光標(biāo)記核酸檢測(cè)方法靈敏度的一個(gè)重要因素為:發(fā)光信號(hào)會(huì)由于磁珠的遮蔽作用而大大減弱一一靈敏度降低最高可達(dá)90%。但現(xiàn)有技術(shù)僅有熒光檢測(cè)法采用高溫使雙鏈核酸變性解鏈的方法分離熒光標(biāo)記物，因?yàn)闊晒鈽?biāo)記物如熒光素(Cy3，Cy5)等可耐受高溫。但化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法等的發(fā)光標(biāo)記物無(wú)法通過(guò)高溫的方式達(dá)到此目的，因?yàn)榛瘜W(xué)發(fā)光標(biāo)記物等無(wú)法耐受高溫，當(dāng)高溫時(shí)會(huì)失活而無(wú)法繼續(xù)進(jìn)行發(fā)光檢測(cè)。因此，研制出一種通用的基于磁珠與分離發(fā)光標(biāo)記物的核酸檢測(cè)方法，能夠極大地提高熒光、尤其是化學(xué)發(fā)光的檢測(cè)靈敏度，這對(duì)于疾病分子診斷、食品微生物監(jiān)測(cè)等具有重大意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]技術(shù)問(wèn)題:本發(fā)明所要解決的主要技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有的基于磁珠與發(fā)光標(biāo)記物的核酸檢測(cè)方法存在的檢測(cè)靈敏度受限問(wèn)題，其原因是磁珠對(duì)光信號(hào)產(chǎn)生遮蔽效應(yīng)，極大地減弱了發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度。因此，提出一種基于磁珠與多糖水解分離發(fā)光標(biāo)記物的核酸檢測(cè)方法。
[0009]技術(shù)方案:本發(fā)明的一種基于磁珠與多糖水解分離發(fā)光標(biāo)記物的核酸檢測(cè)方法包括:
[0010]I)在磁珠表面修飾適合連接核酸探針的多糖分子；
[0011]2)設(shè)計(jì)用于檢測(cè)靶核酸片段的功能化探針，將功能化探針修飾于結(jié)合有多糖分子的磁珠表面；
[0012]3)通過(guò)雜交，將靶核酸片段及其發(fā)光標(biāo)記物捕獲至磁珠表面；
[0013]4)磁分離，清洗，即得到已獲取發(fā)光標(biāo)記物的磁珠；
[0014]5)加入多糖水解試劑，通過(guò)多糖水解將發(fā)光標(biāo)記物從磁珠表面分離下來(lái)，即得到不含磁珠的發(fā)光標(biāo)記物溶液；
[0015]6)對(duì)該發(fā)光標(biāo)記物溶液進(jìn)行發(fā)光檢測(cè)，即可獲取靶核酸信息。
[0016]其中:
[0017]步驟I)所述表面修飾包括但不限于在磁珠表面以共價(jià)鍵、非共價(jià)鍵或物理吸附方式修飾功多糖分子。所述多糖分子是能夠同時(shí)與磁珠及功能化探針以共價(jià)鍵、非共價(jià)鍵或物理吸附的方式結(jié)合的多糖。
[0018]多糖包括葡聚糖、殼聚糖、纖維素或聚乙二醇及其衍生物。
[0019]步驟2)所述靶核酸片段為非擴(kuò)增或經(jīng)擴(kuò)增后的核酸片段。所述功能化探針為能夠與多糖分子共價(jià)結(jié)合或物理吸附，并與靶核酸片段序列互補(bǔ)的寡核苷酸。
[0020]步驟3)所述發(fā)光標(biāo)記物為適用于分子檢測(cè)的能夠產(chǎn)生發(fā)光信號(hào)的分子，包括熒光標(biāo)記物如熒光素Cy3或Cy5，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物如堿性磷酸酶及其化學(xué)發(fā)光底物、辣根過(guò)氧化物酶及其化學(xué)發(fā)光底物。所述發(fā)光標(biāo)記物，其標(biāo)記靶核酸的方式包括通過(guò)靶核酸擴(kuò)增進(jìn)行標(biāo)記、通過(guò)報(bào)告探針與靶核酸片段雜交進(jìn)行標(biāo)記。
[0021]步驟5)所述多糖水解試劑為能夠水解多糖的化學(xué)或生物試劑，包括多糖水解酶如葡聚糖酶、殼聚糖酶或纖維素酶。
[0022]步驟6)所述發(fā)光檢測(cè)為基于分子標(biāo)記的發(fā)光檢測(cè)體系，包括熒光、化學(xué)發(fā)光或其他波長(zhǎng)的光。
[0023]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下特點(diǎn):
[0024]多糖作為分子手臂將功能化探針連接于磁珠表面，提高了顆粒懸浮性、減小了空間位阻、增加了探針結(jié)合位點(diǎn)以及增加了雜交自由度，從而提高了雜交效率。將對(duì)應(yīng)靶核酸片段的發(fā)光標(biāo)記物從磁珠表面分離下來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，避免了磁珠遮蔽效應(yīng)，提高了發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度。因此，本發(fā)明技術(shù)極大地提高了檢測(cè)靈敏度。
【附圖說(shuō)明】
[0025]以下結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述:
[0026]圖1為一種基于葡聚糖修飾磁珠與葡聚糖水解分離發(fā)光標(biāo)記物的核酸檢測(cè)方法流程示意圖。
[0027]圖2為HBV核酸PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。
[0028]圖3為HBV核酸的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)動(dòng)力曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0029]本發(fā)明公布了一種利用磁珠易于磁分離的特性結(jié)合雜交以及多糖水解分離發(fā)光標(biāo)記物的策略，對(duì)不含磁珠的發(fā)光標(biāo)記物溶液進(jìn)行發(fā)光檢測(cè)，獲取靶核酸信息的方法。在本發(fā)明的一個(gè)較佳的實(shí)例中，以Fe3O4OS12磁珠作為載體，在其表面修飾多糖分子，連接上功能化探針，以生物素標(biāo)記靶核酸片段，通過(guò)核酸雜交將帶生物素標(biāo)記的靶核酸片段捕獲至磁珠表面，通過(guò)與親和素標(biāo)記酶孵育使磁珠獲取對(duì)應(yīng)靶核酸片段的酶分子，然后利用葡聚糖酶水解葡聚糖將對(duì)應(yīng)靶核酸片段的酶分子從磁珠表面分離下來(lái)，最后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，獲取靶核酸信息。其步驟如下:
[0030]1.在磁珠表面修飾多糖分子: