經(jīng)高密度納米點(diǎn)陣列制備生物大分子單分子芯片的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物芯片制作技術(shù)，具體是一種生物大分子(即DNA、RNA和蛋白質(zhì))高密度單分子芯片的制作方法。
【背景技術(shù)】
[0002]高密度生物大分子(DNA、RNA和蛋白質(zhì))單分子芯片，即每一個(gè)樣點(diǎn)只有一個(gè)生物大分子，樣點(diǎn)間距達(dá)到光學(xué)分辨率極限，可以實(shí)現(xiàn)單位面積的數(shù)據(jù)量最大化；各樣點(diǎn)上的單分子，可通過分子生物學(xué)手段修飾后用作“誘餌”，捕獲靶分子，既可用于分子間如抗原與抗體間的相互作用、DNA雜交檢測單核苷酸多態(tài)性、拷貝數(shù)變異和比較基因組雜交芯片等，也可用于DNA合成法測序、連接法測序等，將第二代測序技術(shù)轉(zhuǎn)換為第三代測序技術(shù)。但是，生物大分子單分子芯片的制作難度大，傳統(tǒng)的方法采用稀釋的生物大分子溶液鋪設(shè)，有很大的隨機(jī)性，有許多分子因相互重疊而無法觀察；此外，基底上部分區(qū)域樣點(diǎn)極少或沒有樣品，檢測效率降低。迄今，還沒有比較有效的高密度生物大分子單分子芯片制作技術(shù)。
[0003]經(jīng)對(duì)現(xiàn)有文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，2010年，Complete Genomics (華大基因)公司在SCIENCE(第327卷，第78-81 頁)發(fā)表了題為“Human Genome Sequencing Using UnchainedBase Reads on Self-Assembling DNA Nanoarrays”論文。該項(xiàng)技術(shù)將經(jīng)滾環(huán)復(fù)制后形成的DNA納米球樣品固定到預(yù)先制備好的硅基陣列中，大大增加了芯片表面檢測樣點(diǎn)的密度，有效地提高了 DNA測序通量和試劑的使用效率。但是，滾環(huán)復(fù)制后進(jìn)入陣列的DNA并非來自天然基因組的單拷貝片段，而是短片段的多重拷貝，也即該芯片不是真正意義上的單分子DNA芯片。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是指提供單分子狀態(tài)的高通量生物芯片。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的單分子芯片制作技術(shù)，即經(jīng)高密度納米點(diǎn)陣列制備生物大分子單分子芯片，該方法可將單個(gè)生物大分子固定于納米陣列，通過單分子樣點(diǎn)的間距控制，建立高密度、多功能生物大分子的單分子芯片。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:在基底上鋪設(shè)一層薄膜，再在薄膜上制備納米坑陣列，經(jīng)進(jìn)一步基底修飾(02等離子體處理基底進(jìn)行羥基化，再經(jīng)修飾使之生物素化)，去除薄膜后形成可連接生物大分子的活性納米點(diǎn)陣列，因納米點(diǎn)足夠小，只能連接一個(gè)生物大分子；最后清洗基底，獲得高密度的單分子生物芯片。
[0006]所述方法具體按照如下步驟實(shí)施:
[0007]第一步，納米陣列基底的制備:在潔凈的基底上鍍一層薄膜，厚度不超過I個(gè)生物大分子的直徑；
[0008]第二步，納米坑陣列的制備:刻蝕薄膜，直至基底暴露，制作出直徑小于I個(gè)生物大分子的納米坑陣列；
[0009]第三步，活性納米點(diǎn)陣列的制備:通過化學(xué)方法修飾基底，使之各部分?jǐn)y帶上活性基團(tuán)A，去除薄膜后形成帶活性基團(tuán)A的納米點(diǎn)陣列；
[0010]第四步，單分子生物芯片的制備:將攜帶可以與活性基團(tuán)A發(fā)生連接反應(yīng)的活性基團(tuán)B的生物大分子，在連接溶液中與基底發(fā)生連接反應(yīng)；因?yàn)榧{米點(diǎn)的直徑小于2個(gè)生物大分子，因此，各個(gè)納米點(diǎn)只能連接I個(gè)生物大分子，反應(yīng)完成后經(jīng)清洗，獲得高密度生物大分子單分子芯片。
[0011]優(yōu)選地，所述的基底，可以采用常用的基底材料，包括但不限于石英，玻璃片，硅片，云母片等。
[0012]優(yōu)選地，所述的薄膜，包括但不限于PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)光刻膠正膠、PMMA/MA共聚物正膠和LIGA正膠等材料。
[0013]優(yōu)選地，所述的在基底上鍍一層薄膜，可以采用旋涂光刻膠等方法，薄膜厚度不大于生物大分子的直徑。
[0014]優(yōu)選地，所述的納米點(diǎn)，按照所制作的單分子生物芯片的要求，保證其直徑小于I個(gè)生物大分子的直徑，即單個(gè)活性納米點(diǎn)中最多只能連接一個(gè)生物大分子。
[0015]優(yōu)選地，根據(jù)需要，所述的納米點(diǎn)中心間距可以< 1000納米，這是根據(jù)所采用的熒光分子的波長而定，兩個(gè)相鄰的熒光分子有分辨率極限，當(dāng)前的高分辨率光學(xué)顯微鏡的分辨極限為200納米，隨著科學(xué)技術(shù)進(jìn)步，有了突破當(dāng)前分辨極限的顯微鏡，本發(fā)明的納米孔中心間距，還可以隨之降低；本發(fā)明也可以制備納米點(diǎn)中心間距超過1000納米的陣列，但芯片上的樣點(diǎn)量將大幅度下降，檢測的信息量也會(huì)隨之降低。
[0016]優(yōu)選地，所述的生物大分子，可以是蛋白質(zhì)的單體、二聚體和多聚體(包括抗體)，也可以是單個(gè)蛋白質(zhì)攜帶單根核酸分子的復(fù)合物；所述核酸分子，可以是DNA，也可以是RNA0
[0017]優(yōu)選地，所述的活性基團(tuán)A與B，是指二者能夠發(fā)生免疫綁定、直接或介導(dǎo)形成共價(jià)鍵的活性基團(tuán)對(duì)，凡是能夠?qū)崿F(xiàn)該目的的活性基團(tuán)對(duì)均可，包括但不限于:生物素-抗生物素蛋白、地高辛-抗地高辛抗體、氨基-環(huán)氧基、氨基-羧基(包括羧基的活化形式如琥珀酰亞胺碳酸酯等)、氨基-羰基、巰基-馬來酰亞胺、巰基-環(huán)氧基、巰基-巰基、巰基-羰基、羧基-酰肼基、羰基-酰肼基等。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果:
[0019]與國內(nèi)外同類芯片相比，本發(fā)明采用的制備工藝簡單，適于大規(guī)模的單分子芯片制備，單分子樣點(diǎn)間距可控，單分子連接效率接近100%。可用于超靈敏單分子酶聯(lián)免疫吸附分析、基于雜交的DNA變異檢測、單分子DNA合成和連接測序以及單細(xì)胞RNA測序等。
【附圖說明】
[0020]通過閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯:
[0021]圖1為規(guī)則納米點(diǎn)陣列的制備流程示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022]以下實(shí)例將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。全部實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例及附圖所采用的方法。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造商所建議的條件進(jìn)行。
[0023]以下實(shí)施例中，對(duì)于制備得到的生物大分子單分子芯片的檢測:用熒光分子標(biāo)記生物大分子，清洗后，在高分辨熒光顯微鏡下檢測。當(dāng)然，所述的用熒光分子標(biāo)記生物大分子后檢測，也可以在固定生物大分子前，用焚光分子標(biāo)記生物大分子后檢測。
[0024]單分子芯片的質(zhì)量檢測，可以采用熒光標(biāo)記的方法在熒光顯微鏡下檢測，也可以采用非熒光檢測方法，如原子力顯微鏡檢測。
[0025]實(shí)施例1
[0026]第一步，在Piranha溶液和無離子水清洗后的硅基底上旋涂厚度1nm的光刻膠PMMA0
[0027]第二步，用電子束光刻技術(shù)在底片光刻顯影出30nm的納米坑圖形(納米點(diǎn)直徑控制在只能容納I個(gè)核酸裝載工具)，通過掩模版設(shè)計(jì)將納米坑間距控制在500nm。
[0028]第三步，將顯影后的基底用等離子體處理使硅表面羥基化；丙酮清洗基底去除PMMA薄膜，獲得羥基化納米點(diǎn)陣列。
[0029]第四步，用APTES溶液處理基底，使納米點(diǎn)表面氨基化，清洗后用B1tin-NHS處理，使納米點(diǎn)表面選擇性生物素化。
[0030]第五步，通過免疫反應(yīng)，將四聚體抗鏈霉生物素-單條DNA復(fù)合物固定到納米點(diǎn)，因納米點(diǎn)直徑足