物由SEQIDNO. 1所 示的外引物上游引物和SEQIDNO. 2所示的外引物下游引物組成；內引物由SEQIDNO. 3 所示的內引物上游引物和SEQIDNO. 4所示的內引物下游引物組成。
[0038] 實施例2
[0039] 維氏氣單胞菌快速檢測試劑盒，包括：
[0040] (1)TE緩沖液，其組成為 20mmol/LTris-HCl，2mmol/LEDTA，溶齊IJ是蒸餾水，pH= 8. 0 ；
[0041] (2)BstDNA聚合酶：濃度為8U/y1的BstDNA聚合酶；
[0042] (3)LAMP反應液，24y1LAMP反應液的組成為：2. 5y1 10X反應緩沖液；3y1濃 度為2. 5mmol/L的dNTP;lyl濃度為5ymol/L的由SEQIDNO. 1所示的外引物上游引物， lul濃度為5ymol/L的由SEQID勵.2所示的外引物下游引物，1^1濃度為40錢〇1/1 的由SEQIDNO. 3所示的內引物上游引物，lyl濃度為40ymol/L的由SEQIDNO. 4所示 的內引物下游引物；1u1鈣黃綠素與錳離子形成的配合物；13. 5y1DEPC水；
[0043] (4)陽性對照膜片，用下述方法制成：吸取維氏氣單胞菌培養(yǎng)液將FTA膜片充分潤 濕后室溫干燥，放入盛有200y1TE緩沖液的洗滌管中震蕩洗滌2次，每次4min，充分干燥；
[0044] (5)陰性對照膜片，用下述方法制成：吸取DEPC水將FTA膜片充分潤濕后室溫干 燥，放入盛有200y1TE緩沖液的洗滌管震蕩洗滌2次，每次4min，充分干燥；
[0045] (6)無菌封裝的FTA膜片、研磨棒、吸管，采集管，洗滌管，檢測管。
[0046] 實施例3
[0047] 維氏氣單胞菌快速檢測試劑盒，包括：
[0048] (1)_(3)同實施例 2 的（1)-(3);
[0049] (4)陽性對照膜片，用下述方法制成：吸取維氏氣單胞菌培養(yǎng)液將FTA膜片充分潤 濕后室溫干燥，放入盛有200y1TE緩沖液的洗滌管中震蕩洗滌2次，每次3min，充分干燥；
[0050] (5)陰性對照膜片，用下述方法制成：吸取DEPC水將FTA膜片充分潤濕后室溫干 燥，放入盛有200y1TE緩沖液的洗滌管震蕩洗滌2次，每次3min，充分干燥；
[0051] (6)同實施例2的（6)。
[0052] 實施例4
[0053] 維氏氣單胞菌快速檢測試劑盒，包括：
[0054] (1)_(3)同實施例 2 的（1)-(3);
[0055] (4)陽性對照膜片，用下述方法制成：吸取維氏氣單胞菌培養(yǎng)液將FTA膜片充分潤 濕后室溫干燥，放入盛有200y1TE緩沖液的洗滌管中震蕩洗滌2次，每次5min，充分干燥；
[0056] (5)陰性對照膜片，用下述方法制成：吸取DEPC水將FTA膜片充分潤濕后室溫干 燥，放入盛有200y1TE緩沖液的洗滌管震蕩洗滌2次，每次5min，充分干燥；
[0057] (6)同實施例2的（6)。
[0058] 實施例5
[0059] 維氏氣單胞菌快速檢測試劑盒檢測方法的建立
[0060] (1)模板制備：采用DNA提取試劑盒（天根的快速DNA提取檢測試劑盒KG203)提 取的純培養(yǎng)的維氏氣單胞菌基因組DNA，作為陽性對照液，以純培養(yǎng)的維氏氣單胞菌菌液， 作為檢測樣品，測試所建立檢測方法的可行性。
[0061] ⑵引物設計合成
[0062] 采用BLAST軟件分析維氏氣單胞菌基因（AB290200. 1)序列，篩選出維氏氣單胞菌 Aeromonasveronii基因的核酸序列，根據(jù)LAMP技術引物設計原則，針對該片段設計出LAMP 引物并合成，所用引物如下：
[0063]
【主權項】
1. 維氏氣單胞菌快速檢測引物，其特征是由外引物和內引物組成，所述外引物由SEQ ID NO. 1所示的外引物上游引物和SEQ IDNO. 2所示的外引物下游引物組成；所述內引物由 SEQ ID NO. 3所示的內引物上游引物和SEQ IDN0. 4所示的內引物下游引物組成。
2. -種維氏氣單胞菌快速檢測試劑盒，其特征是包括： (1) TE 緩沖液，其組成為 20mmol/LTris-HCl，2mmol/LEDTA，溶齊IJ是蒸饋水，pH = 8. 0 ; (2) BstDNA聚合酶；濃度為8U/ y 1的BstDNA聚合酶； (3) LAMP反應液，24 y 1 LAMP反應液的組成為；2. 5 y 1 10 X反應緩沖液；3 y 1濃度為 2. 5mmol/L的dNTP ;1 y 1濃度為5 ymol/L的由SEQ ID NO. 1所示的外引物上游引物，1 y 1 濃度為5ymol/L的由SEQ ID NO. 2所示的外引物下游引物，lyl濃度為40ymol/L的由 SEQ ID NO. 3所示的內引物上游引物，lyl濃度為40ymol/L的由SEQ ID NO. 4所示的內 引物下游引物；1 y 1巧黃綠素與鋪離子形成的配合物、13. 5 y 1 DEPC水； (4) 陽性對照膜片，用下述方法制成；吸取維氏氣單胞菌培養(yǎng)液將FTA膜片充分潤濕后 室溫干燥，放入盛有200 y 1TE緩沖液的洗漆管中震蕩洗漆2次，每次3?5min，充分干燥； (5) 陰性對照膜片，用下述方法制成；吸取DEPC水將FTA膜片充分潤濕后室溫干燥，放 入盛有200 y 1TE緩沖液的洗漆管震蕩洗漆2次，每次3?5min，充分干燥； (6) 無菌封裝的FTA膜片、研磨椿、吸管，采集管，洗漆管，檢測管。
3. 權利要求2的一種維氏氣單胞菌快速檢測試劑盒的應用，其特征是包括如下步驟： (1) 取待檢魚脾、魚腎或魚肝加入盛有200 y 1TE緩沖液的采集管中，研磨椿研磨至漿 狀； (2) 用吸管吸取步驟（1)獲得的漿狀物或魚血液或維氏氣單胞菌液，將FTA膜片充分潤 濕后室溫干燥；放入盛有200 y 1TE緩沖液的洗漆管中震蕩洗漆2次，每次3?5min，充分 干燥； (3) 將步驟（2)獲得的膜片和一個陽性對照膜片、一個陰性對照膜片分別放入盛有 24 y 1 LAMP反應液的檢測管中，每個檢測管中分別加入1 y 1 BstDNA聚合酶，混勻，置于 60-65°C條件下保溫40?60min，得到檢測液、陽性對照和陰性對照； (4) 陰性對照呈澄色，陽性對照呈綠色，根據(jù)檢測液顏色判斷是否含有維氏氣單胞菌。
【專利摘要】本發(fā)明公開了維氏氣單胞菌快速檢測引物、試劑盒及應用，維氏氣單胞菌快速檢測引物，其特征是由外引物和內引物組成，所述外引物由SEQ ID NO.1所示的外引物上游引物和SEQ ID NO.2所示的外引物下游引物組成；所述內引物由SEQ ID NO.3所示的內引物上游引物和SEQ ID NO.4所示的內引物下游引物組成。本發(fā)明的方法檢測維氏氣單胞菌周期短、檢測成本低、實現(xiàn)了檢測過程的程序化和標準化，操作規(guī)范，不易出錯。特異性好。采用內置染料的方法，反應結束后不用打開反應管，取出后直接肉眼觀察結果，避免了被擴增產物污染后續(xù)待檢樣品，不經過細菌培養(yǎng)，僅需取少量魚類血液等樣品即可進行檢測。
【IPC分類】C12Q1-04, C12Q1-68, C12R1-01
【公開號】CN104531885
【申請?zhí)枴緾N201510018236
【發(fā)明人】姚學良, 徐曉麗, 張振奎, 臧莉, 蔡琰, 鄭艷坤, 任涵瑋
【申請人】天津市水產技術推廣站
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2015年1月14日