e凝膠的影像，其顯示使用Ni-MAC柱的純化步驟的各階段的CBS 蛋白和雜質(zhì)的相對量。
[0035] 圖11為概括自使用Cu-IMAC柱的放大型運行的純化概要。
[0036] 圖12為匯總表，其顯示在使用Zn-IMAC柱的純化法之后的總蛋白。
[0037] 圖13為SDS page凝膠的影像，其顯示使用Zn-MAC柱的純化步驟的各階段的CBS 蛋白和雜質(zhì)的相對量。
[0038] 圖14為使用多步色譜純化步驟的純化法的方案。
[0039] 發(fā)明詳沐 本發(fā)明提供用于純化CBS蛋白的方法，其中所述CBS蛋白為天然存在的截短變體，或其 經(jīng)化學切割或基因工程改造的截短物，尤其為在重組細胞中產(chǎn)生的截短蛋白質(zhì)CBS。具體 而言，本發(fā)明提供用于純化CBS蛋白的方法，所述方法包括以下步驟：(a)提供存在至少一 種雜質(zhì)的含CBS的溶液；和（b)使用金屬親和色譜（IMAC)樹脂進行所述含CBS溶液的色譜 分離。在另外的具體實施方案中，所述方法包括以下步驟：(a)提供存在至少一種雜質(zhì)的含 CBS的溶液；和（b)使用離子交換色譜柱和金屬親和色譜（IMAC)樹脂進行所述含CBS溶液 的色譜分離。
[0040] 本發(fā)明提供的方法的某些實施方案中的具體色譜分離步驟包含離子交換色譜柱。 在一個實施方案中，所述離子交換色譜柱為陰離子交換柱，優(yōu)選弱陰離子交換柱?？墒褂?多種類型的陰離子交換樹脂，包括DEAE-葡聚糖凝膠、QAE-葡聚糖凝膠、DEAE-葡聚糖纖 維素、DEAE-纖維素和DEAE-瓊脂糖凝膠-FF。根據(jù)一個實施方案，所述陰離子交換樹脂為 DEAE-瓊脂糖凝膠-FF。
[0041] 本發(fā)明提供的某些方法中的另一種具體的色譜分離步驟包含金屬親和色譜 (IMAC)樹脂，其具有適當?shù)膒H和電導率，以便在使用選擇性中間洗滌以去除較弱結(jié)合蛋白 和其它分子物質(zhì)的同時，允許所述蛋白質(zhì)與柱結(jié)合。在某些實施方案中，利用改變咪唑的濃 度來調(diào)節(jié)色譜法期間的分配。合適的金屬親和樹脂包括荷載有二價金屬離子（包括鎳、銅、 鈷或鋅）的固定化金屬親和柱。在本發(fā)明的方法的某些實施方案中，在離子交換色譜之后 使用金屬親和色譜（IMAC)柱。在這類實施方案中，所述IMAC柱優(yōu)選荷載有作為二價陽離 子的鋅。在本發(fā)明方法的其它實施方案中，將IMAC柱用作初始色譜步驟。在這類實施方案 中，優(yōu)選使用鎳或銅二價陽離子荷載IMAC柱。
[0042] 在本發(fā)明的方法的某些實施方案中提供的用于從含CBS的溶液中純化CBS的另外 的色譜步驟包括但不限于疏水相互作用色譜（HIC)。HIC對于去除在捕獲步驟期間與靶蛋 白一起洗脫的具有相對密切相關(guān)的色譜性質(zhì)的雜質(zhì)而言為有用的。
[0043] 在本發(fā)明的方法的某些實施方案中提供的用于從含CBS的溶液中純化CBS的再 進一步的色譜步驟包括但不限于陶瓷羥磷灰石樹脂。"陶瓷羥磷灰石"或"CHAP"是指式 (Ca ltl(P04)6(0H)2)的不可溶的羥基化磷酸媽，其在高溫下燒結(jié)成球狀大孔陶瓷形式。本發(fā)明 的方法亦可與松散的或裝填在柱中的羥磷灰石樹脂一起使用。柱尺寸的選擇可由技術(shù)人員 來確定。
[0044] 在本發(fā)明的方法中有用的色譜基質(zhì)為能夠結(jié)合生化化合物（優(yōu)選蛋白質(zhì)、核酸和 /或內(nèi)毒素）的物質(zhì)，其中所述生化化合物對所述色譜基質(zhì)的親和力受到周圍溶液（緩沖 液）的離子組成所影響。控制所述溶液的離子組成允許以除去模式（CBS通過所述色譜基 質(zhì)，至少某些污染物與所述色譜基質(zhì)結(jié)合）或優(yōu)選以吸附模式（CBS與所述色譜基質(zhì)結(jié)合） 使用本發(fā)明的色譜物質(zhì)。
[0045] 在具體的實施方案中，用于純化的方法包括均質(zhì)化宿主細胞（尤其是重組細胞以 及在某些實施方案中為產(chǎn)生哺乳動物優(yōu)選人CBS蛋白的重組細胞）的步驟，其中所述重組 構(gòu)建體編碼CBS蛋白，所述CBS蛋白為天然存在的截短變體，或其經(jīng)基因工程改造的截短 物，尤其為其中所述構(gòu)建物已針對重組細胞表達最優(yōu)化。在具體的實施方案中，所述重組細 胞為微生物細胞，尤其為細菌細胞。在某些具體的實施方案中，所述細菌細胞為大腸桿菌細 胞并且所述CBS序列已在重組表達構(gòu)建體中進行工程改造，以針對在所述細胞中的表達最 優(yōu)化；針對在大腸桿菌中的CBS表達最優(yōu)化的所述核酸序列的具體實施方案闡述于SEQ ID NO: 4中。在所述方法中，收集細胞（例如通過離心），并任選儲存于-80°C。宿主細胞的均 質(zhì)化通過使用物理、化學或酶促方式或通過其組合破壞所述細胞宿主來進行。有利的是，對 于自細菌來源的純化，均質(zhì)化通過用超聲處理破壞所述細菌宿主的細胞壁來進行。備選或 另外地，均質(zhì)化通過暴露給諸如溶菌酶等細胞壁降解酶使宿主的細菌細胞壁失穩(wěn)來進行。
[0046] 本發(fā)明的方法可進一步包含澄清的CBS勻衆(zhòng)，其中細胞碎片已通過過濾或離心從 所述勻漿中去除。在某些實施方案中，通過以有效的轉(zhuǎn)速將勻漿離心來進行澄清。所需的 離心時間尤其取決于勻漿的體積，其可憑經(jīng)驗確定以獲得足夠緊實的沉淀。為了獲得基本 上不含細胞碎片的澄清勻漿，可對所述勻漿進行離心和過濾的組合。
[0047] 本文所用的術(shù)語"重組細胞"是指已向其中引入重組表達構(gòu)建體的來自任何物種 的合適細胞（包括這類細胞的子代），所述重組表達構(gòu)建體能夠表達這樣的核酸，其編碼 CBS蛋白，優(yōu)選人CBS蛋白，最尤其其為天然存在的截短變體、或其經(jīng)化學切割或基因工程 改造的截短物的人CBS蛋白。在具體的實施方案中，通過所述重組表達構(gòu)建體編碼的截短 的CBS蛋白具有如在SEQ ID NO: 3中所闡述的氨基酸序列。
[0048] 本文所用的術(shù)語"細菌細胞"是指尤其使用重組基因法產(chǎn)生哺乳動物（優(yōu)選人） CBS蛋白的細菌，其包括所述重組細胞的子代，其中所述CBS蛋白為天然存在的截短變體， 或其經(jīng)基因工程改造的截短物。
[0049] 本文所用的術(shù)語"重組表達構(gòu)建體"是指這樣的核酸，其具有哺乳動物（優(yōu)選人） CBS蛋白的核苷酸序列，以及足以指導CBS蛋白在已向其中引入所述重組表達構(gòu)建體的細 胞及其子代的培養(yǎng)物中合成的序列。
[0050] 如在本文中所使用，提及CBS蛋白或多肽優(yōu)選包括天然存在的截短變體，或其經(jīng) 化學切割或基因工程改造的截短物，或融合蛋白，或其任何同源物（變體、突變體），并且具 體為哺乳動物CBS及優(yōu)選人CBS。所述CBS蛋白可包括但不限于純化的CBS蛋白、重組產(chǎn)生 的CBS蛋白、可溶性CBS蛋白、不溶性CBS蛋白以及與其它蛋白質(zhì)締合的分離的CBS蛋白。 此外，"人CBS蛋白"是指來自人（人類（//〇?〇 )的CBS蛋白，優(yōu)選包括天然存在的 截短變體，或其經(jīng)化學切割或基因工程改造的截短物。因此，人CBS蛋白可包括純化的、部 分純化的、重組的、突變/修飾的以及合成的蛋白質(zhì)。如在本文中以及在相關(guān)的美國專利號 8, 007, 787和7, 485, 307中所公開，所述CBS蛋白截短物有利地為可溶性CBS蛋白，其在細 菌中產(chǎn)生而不會產(chǎn)生不溶性包涵體。
[0051] 本文所用的術(shù)語"同源物"（或者變體或突變體）是用于表示這樣的蛋白質(zhì)或肽， 其通過對天然存在的蛋白質(zhì)或肽的修飾而不同于所述天然存在的蛋白質(zhì)或肽（即"原型" 或"野生型"蛋白質(zhì)），但保持所述天然存在形式的基本蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和側(cè)鏈結(jié)構(gòu)。這類改變 包括但不限于：在一個、少數(shù)乃至數(shù)個氨基酸側(cè)鏈上的改變；在一個、少數(shù)或數(shù)個氨基酸上 的改變，包括缺失（例如所述蛋白或肽的截短形式）、插入和/或取代；在一個或少數(shù)原子 的立體化學上的改變；和/或較小的衍生化，包括但不限于：甲基化、糖基化、磷酸化、乙酰 化、肉