通過(guò)微小rna診斷類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及測(cè)試衍生自測(cè)試對(duì)象血液的樣品用于確定類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病理狀 態(tài)的方法，用于其的診斷試劑等。
【背景技術(shù)】
[0002] 類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA)是特征在于破壞性關(guān)節(jié)炎的全身性炎性疾病。它的發(fā)病率 據(jù)說(shuō)是全世界人口的1%，并且0.7-1百萬(wàn)患者位于日本，其中每年15, 000人新近發(fā)展該疾 病。近年來(lái)，已闡明類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的不可逆關(guān)節(jié)破壞比常規(guī)預(yù)測(cè)的更早開(kāi)始，并且因此 已推薦從早期開(kāi)始積極使用顯示出高關(guān)節(jié)破壞抑制性作用的生物制劑，這增加類(lèi)風(fēng)濕性關(guān) 節(jié)炎的早期診斷的重要性。
[0003] 微小RNA (miRNA)是長(zhǎng)度約22個(gè)堿基的短鏈RNA分子，并且通過(guò)與其信使RNA的 3'非翻譯區(qū)中的互補(bǔ)序列結(jié)合而抑制靶基因的翻譯。miRNA已知調(diào)節(jié)多種生物現(xiàn)象，并且 整個(gè)基因的1/3假定為處于通過(guò)miRNA的表達(dá)調(diào)節(jié)下。在2008年，顯示miRNA (miR-141) 存在于血漿中，并且可用作前列腺癌的生物標(biāo)記(非專(zhuān)利文件1)，其中由于RNA降解酶的存 在，在血漿中RNA長(zhǎng)久以來(lái)被視為不存在。
[0004] 另一方面，本發(fā)明人已闡明通過(guò)測(cè)量血楽中的miR-16、miR-132、miR_146a、 miR-155和miR-223濃度，可以確定類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，并且可以判斷疾病狀態(tài)，所述miRNA已 報(bào)道為細(xì)胞內(nèi)存在且與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)(專(zhuān)利文件1)。
[0005] [文件列表]
[專(zhuān)利文件] 專(zhuān)利文件 1 :W0 2011/126105 [非專(zhuān)利文件] 非專(zhuān)利文件 1 :Proc Natl Acad Sci USA 2008，105 :10513-10518。
[0006] 發(fā)明概述 待由本發(fā)明解決的問(wèn)題 根據(jù)2010年公布的類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的新分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)轱@著重點(diǎn)在于診斷評(píng)分中風(fēng) 濕病因子和抗CCP抗體的得分，所以即使當(dāng)關(guān)節(jié)腫脹很小時(shí)，這些檢查項(xiàng)目陽(yáng)性的病例也 可以診斷為具有類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，而陰性病例不能診斷為具有類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，除非關(guān)節(jié) 腫脹在11個(gè)或更多部分中發(fā)現(xiàn)。在據(jù)說(shuō)占0.7-1百萬(wàn)人的日本類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中，百 分之三十預(yù)測(cè)為對(duì)于抗CCP抗體是陰性的。因?yàn)楦鶕?jù)目前的診斷標(biāo)準(zhǔn)，診斷在抗CCP抗體 陰性病例中是延遲的，所以需要即使在抗CCP抗體陰性病例中也能進(jìn)行類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的 早期診斷的診斷標(biāo)記。
[0007] 考慮到上述情況，本發(fā)明旨在建立屬于不同于自身抗體例如抗CCP抗體、風(fēng)濕病 因子等那種的類(lèi)別的類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎標(biāo)記，特別是同樣可應(yīng)用于自身抗體陰性病例的標(biāo) 記，并且提供用于確定類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病的存在或不存在和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中癥狀的 進(jìn)展（即，疾病狀態(tài)）的方法。
[0008] 解決問(wèn)題的方法 在實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)的嘗試中，本發(fā)明人全面研究類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者和健康人的血漿 中的miRNA濃度。因此，他們已發(fā)現(xiàn)在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的血漿中比健康人的那些顯 示顯著更高的表達(dá)水平的 miRNA (miR-24、miR-26a、miR-28-5p、miR-28-3p、miR-30c、 miR-125a-5p、miR-126-3p 和 miR-502-5p)。當(dāng)來(lái)自這些 miRNA 的 miR-24、miR-26a 和 miR-125a-5p用作標(biāo)記時(shí)，類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎確定中的靈敏度和特異性分別為63. 7%/89. 5%、 53. 9%/94. 3%和64. 7%/89. 5%，具有最佳截?cái)嘀怠Ｗ鳛槌Ｒ?guī)用于確定類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的最 出名標(biāo)記的風(fēng)濕病因子和抗CCP抗體的靈敏度和特異性據(jù)報(bào)道分別為54%/91%和48%/98% (ARTHRITIS & RHEUMATISM 2000,43(1):155-163)。因?yàn)?miR-24、miR-26a 和 miR-125a-5p 無(wú)一迄今據(jù)報(bào)道與疾病相關(guān)，所以與眾所周知的類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎確定標(biāo)記的那些可比較的 高靈敏度和特異性完全是無(wú)法預(yù)測(cè)的。另外，使用miR-24、miR-30a-5p和miR-125a-5p組 合的三種miRNAs (ePRAM，使用微小RNA估計(jì)的RA概率)的復(fù)合值，可以執(zhí)行靈敏度78. 4%、 特異性92. 3%的測(cè)試，并且進(jìn)一步地，使用現(xiàn)有的抗CCP抗體和這三種miRNA組合，可以執(zhí) 行靈敏度94. 1%、特異性95. 2%的測(cè)試。此外，在抗CCP抗體陽(yáng)性病例和陰性病例之間未觀 察到miR-24、miR_26a和miR-125a_5p表達(dá)水平中的顯著差異，其已闡明miRNA也可用于確 定抗CCP抗體陰性病例中的類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
[0009] 本發(fā)明人還研究了在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的血漿中的miRNA濃度的絕對(duì)值或其 對(duì)數(shù)和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的指數(shù)（VAS、DAS28 (ESR)和DAS28 (CRP))之間的關(guān)聯(lián)。因此， 在VAS和miR-24、miR-26a、miR-30c、miR-126-3p和miR-502-5p;DAS28 (ESR)和miR-24、 miR-26a、miR-30c、miR-30e-3p、miR-126-3p和miR-502-5p;以及DAS28 (CRP)和miR-24、 miR-26a、miR-30c、miR-30e-3p、miR-126-3p和miR-502-5p之間發(fā)現(xiàn)關(guān)聯(lián)，并且發(fā)現(xiàn)這些 miRNA可用作疾病狀態(tài)標(biāo)記。這些miRNA和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎之間的關(guān)系迄今為止尚未報(bào)道。
[0010] 本發(fā)明人已基于這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)行進(jìn)一步研究并且完成本發(fā)明。
[0011] 相應(yīng)地，本發(fā)明如下所述。
[0012] [1]測(cè)試衍生自測(cè)試對(duì)象血液的樣品用于確定類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病理狀態(tài)的方 法，其包括下述步驟： (a) 在衍生自測(cè)試對(duì)象血液的樣品中，測(cè)量選自miR-24、miR-26a、miR-28-5p、 miR-28_3p、miR_30c、miR-30e_3p、miR-125a_5p、miR-126_3p和miR-502_5p的至少一種 miRNA的表達(dá)水平，或miR-24和miR-125a-5p的表達(dá)水平，并且用樣品中的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)miRNA 的表達(dá)水平來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化一種或多種表達(dá)水平。
[0013] [2] [1]的方法，其進(jìn)一步包括下述步驟： (b) 使步驟（a)中測(cè)量的表達(dá)水平與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病理狀態(tài)關(guān)聯(lián)。
[0014] [3] [1]或[2]的方法，其中在步驟（a)中，在衍生自測(cè)試對(duì)象血液的樣品中， 測(cè)量選自miR-24, miR-26a和miR-125a-5p的至少一種miRNA的表達(dá)水平，或miR-24和 miR-125a-5p的表達(dá)水平。
[0015] [4] [3]的方法，其中在步驟（a)中，在衍生自測(cè)試對(duì)象血液的樣品中，測(cè)量 miR-24和miR-125a-5p的表達(dá)水平。
[0016] [5] [3]或[4]的方法，其進(jìn)一步包括下述步驟： (a'）在衍生自測(cè)試對(duì)象血液的樣品中，測(cè)量抗CCP抗體的水平， 其中在步驟（b)中，使步驟（a)中測(cè)量的表達(dá)水平和步驟（a'）中測(cè)量的抗CCP抗體水 平與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病理狀態(tài)關(guān)聯(lián)。
[0017] [6] [3]或[4]的方法，其中所述測(cè)試對(duì)象是抗CCP抗體陰性的。
[0018] [7] [1] - [6]中任一項(xiàng)的方法，其中所述衍生自血液的樣品是血漿。
[0019] [8] [1] - [7]中任一項(xiàng)的方法，其中所述測(cè)試對(duì)象是人。
[0020] [9]用于確定類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病理狀態(tài)的診斷試劑，其包含能夠特異性檢 測(cè)選自 miR-24、miR_26a、miR-28_5p、miR-28_3p、miR_30c、miR-30e_3p、miR-125a_5p、 miR-126-3p和miR-502-5p的至少一種miRNA的核酸探針或核酸引物，或 能夠特異性檢測(cè)miR-24的核酸探針或核酸引物， 和 能夠特異性檢測(cè)miR-125a-5p的核酸探針或核酸引物。
[0021] [10] [9]的診斷試劑，其包含能夠特異性檢測(cè)選自miR-24、miR-26a和 miR-125a-5p的至少一種miRNA的核酸探針或核酸引物，或 能夠特異性檢測(cè)miR-24的核酸探針或核酸引物， 和 能夠特異性檢測(cè)miR-125a-5p的核酸探針或核酸引物。
[0022] [11] [10]的診斷試劑，其包含能夠特異性檢測(cè)miR-24的核酸探針或核酸引物， 和 能夠特異性檢測(cè)miR-125a-5p的核酸探針或核酸引物。
[0023] [12] [9] - [11]中任一項(xiàng)的診斷試劑，其進(jìn)一步包含環(huán)狀瓜氨酸肽。
[0024] [13] [1] - [8]中任一項(xiàng)的方法，其中所述內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)miRNA是miR-30a-5p。
[0025] [14] [9] - [12]中任一項(xiàng)的診斷試劑，其進(jìn)一步包含能夠特異性檢測(cè) miR-30a-5p的核酸探針或核酸引物。
[0026] [1' ]測(cè)試衍生自測(cè)試對(duì)象血液的樣品用于確定類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病理狀態(tài)的方 法，其包括下述步驟： (a) 在衍生自測(cè)試對(duì)象血液的樣品中，測(cè)量選自miR-24、miR-26a、miR-28