一種毛竹葉中四種黃酮碳苷提取和純化工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種黃酮碳苷提取和純化工藝，具體涉及一種毛竹葉中四種黃酮碳苷 提取和純化工藝。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃酮類(lèi)化合物因其結(jié)構(gòu)和來(lái)源不同，溶解特性也有很大差異，因此可根據(jù)極性選 擇合適的溶劑進(jìn)行提取。目前，提取方法主要有：水提法、堿性水或稀醇提取法、有機(jī)溶劑熱 回流提取法、微波輔助萃取法、超聲波提取法、超臨界萃取法等。
[0003] 水提法，用于黃酮苷類(lèi)物質(zhì)提取，成本低，適用于工業(yè)生產(chǎn)，但提取液中含蛋白質(zhì)、 多糖等溶于水的雜質(zhì)，提取效率低，易霉變，后續(xù)分離麻煩。堿性水或稀醇提取法，利用黃酮 類(lèi)化合物中酚羥基基團(tuán)溶于堿水遇酸后又沉淀析出的特點(diǎn)，用于黃酮類(lèi)化合物的提取。在 提取過(guò)程中，加入的酸堿濃度要適量，堿濃度過(guò)高會(huì)破壞黃酮母核結(jié)構(gòu)，而酸濃度過(guò)高又會(huì) 與黃酮的羥基生成佯鹽，導(dǎo)致沉淀物析出后重新溶解，降低得率。有機(jī)溶劑熱回流提取法， 是目前國(guó)內(nèi)外使用最廣泛的提取方法，常用的有機(jī)溶劑有乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇等；某 些強(qiáng)極性酚酸（苯甲酸，肉桂酸等）不能完全用純有機(jī)溶劑提取，采用乙醇-水配比混合 液提取效果更佳；二氯甲烷、氯仿、正己烷等某些極性較小的溶劑適用于非極性化合物的提 取，如蠟、留醇、葉綠素等。一定濃度的乙醇或甲醇水溶液最常用于黃酮類(lèi)化合物的提取，高 濃度的醇溶液（90%以上）適宜于提取苷元，低濃度的醇溶液則適宜于提取苷類(lèi)。微波輔 助萃取法，是利用不同的物質(zhì)在微波場(chǎng)中吸收微波能力的差異，待提取物中某些組分首先 被選擇性加熱，與體系分離后進(jìn)入介電常數(shù)小、微波吸收能力相對(duì)差的提取劑，具有高選擇 性、后處理方便、對(duì)環(huán)境安全無(wú)害等特點(diǎn)。超聲波提取法是利用超聲波空化作用，加速植物 有效成分浸出的過(guò)程，具有高效、快速、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。超臨界流體萃取主要是利用超臨 界流體的特性進(jìn)行分離，超臨界流體既有對(duì)溶質(zhì)溶解度大的特征，又有氣體易于分散和運(yùn) 動(dòng)的特點(diǎn)；當(dāng)處于臨界狀態(tài)時(shí)，溫度和壓力的微小改變，引起超臨界流體密度的顯著變化， 從而使其溶解能力也發(fā)生相應(yīng)變化，一般常選用〇) 2作為超臨界流體，萃取植物中的有效成 分。超臨界流體萃取提取效率高，活性組分和熱不穩(wěn)定成分不易被分解，能耗低，不產(chǎn)生任 何新的"三廢"物質(zhì)，對(duì)環(huán)境保護(hù)有利。研宄人員利用超臨界CO2萃取技術(shù)從藤茶莖中萃取 黃酮類(lèi)和酚類(lèi)物質(zhì)，并對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化；還考察了藤茶莖提取物對(duì)DPPH自由基清除能 力和與亞鐵離子的螯合作用，結(jié)果表明，提取物對(duì)DPPH自由基表現(xiàn)出極強(qiáng)的清除能力，但 與亞鐵離子的螯合作用卻很弱，此外，利用HPLC技術(shù)從提取物中檢測(cè)到文獻(xiàn)中未報(bào)道過(guò) 的一些黃酮類(lèi)化合物，包括芹菜素，牡荊苷，木犀草素等。
[0004] 在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，常用大型設(shè)備對(duì)竹葉進(jìn)行熱回流提取，提取效率雖不及超聲 波提取、微波輔助萃取和超臨界流體萃取的效果高，但熱回流提取生產(chǎn)成本低，易于操作， 適用于大批量工業(yè)化生產(chǎn)。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)中涉及的純化方法主要有大孔樹(shù)脂吸附法、柱層析、紙層析法、膜分離、 重結(jié)晶等。大孔樹(shù)脂是一類(lèi)具有大孔結(jié)構(gòu)的高分子聚合物吸附劑，其原理是通過(guò)范德華引 力或氫鍵作用實(shí)現(xiàn)對(duì)黃酮類(lèi)化合物的吸附，此外，由于惰性致孔劑除去后殘留的多孔性結(jié) 構(gòu)也起到分子篩的作用。大孔樹(shù)脂具有吸附選擇性好、解吸條件溫和、使用周期長(zhǎng)、再生簡(jiǎn) 便等優(yōu)點(diǎn)，并且提取率較高、成本費(fèi)用低，適合在制備分離工藝中應(yīng)用，廣泛應(yīng)用于物質(zhì)的 分離純化?？导覄俚葴y(cè)定了 7種大孔樹(shù)脂對(duì)竹葉總黃酮的吸附與解吸過(guò)程，其中AB-8大孔 樹(shù)脂表現(xiàn)出良好的吸附和解吸性能。聚酰胺樹(shù)脂通過(guò)分子中的酚羥基與樹(shù)脂中的酰胺基 基團(tuán)產(chǎn)生氫鍵作用來(lái)實(shí)現(xiàn)吸附過(guò)程，其吸附強(qiáng)度主要取決于黃酮類(lèi)化合物分子中的羥基數(shù) 目、位置以及洗脫劑與黃酮類(lèi)化合物或與聚酰胺之間形成氫鍵締合能力的大小。聚酰胺樹(shù) 脂對(duì)黃酮類(lèi)化合物有很好的富集作用，適于黃酮類(lèi)化合物的大量制備分離工藝。劉會(huì)利用 聚酰胺樹(shù)脂對(duì)淡竹葉中黃酮類(lèi)成分進(jìn)行純化，得到最佳工藝，收集70%乙醇洗脫液得淡竹 葉總黃酮，其含量達(dá)36%。硅膠柱層析，主要用于分離弱極性的黃酮類(lèi)化合物，如異黃酮、二 氫黃酮（醇）和高度甲基化或乙酰化的黃酮和黃酮醇，純化過(guò)程中經(jīng)常選用混合溶劑進(jìn)行 梯度洗脫，氯仿_甲醇、石油醚-丙酮等都是常用的溶劑洗脫組合。膜分離技術(shù)，是在外界 施加壓力時(shí)，提取液通過(guò)濾膜時(shí)，高分子被截留的分離技術(shù)，可有效去除大分子物質(zhì)，如蛋 白質(zhì)、多糖、大分子色素等。在分離過(guò)程中，無(wú)相變化，且提高了藥液澄清度，有效成分含量 也得到很大提高，可實(shí)現(xiàn)選擇性分離。唐浩國(guó)等通過(guò)對(duì)5種超濾膜的對(duì)比研宄，選擇切割分 子量為50000D的聚砜膜PSF-500對(duì)麻竹竹葉黃酮進(jìn)行純化效果更佳，產(chǎn)品得率達(dá)4. 29%。 高紅寧等也通過(guò)陶瓷膜與醇沉的分離效果對(duì)比，結(jié)果表明微濾結(jié)合大孔樹(shù)脂純化技術(shù)對(duì)苦 參水提液中總黃酮處理的吸附率及除雜效果更佳。紙層析和重結(jié)晶工藝在文獻(xiàn)中也有涉 及，但均存在不同程度的缺點(diǎn)而限制了其工業(yè)化生產(chǎn)。
[0006] 現(xiàn)今，也有很多專(zhuān)利報(bào)道過(guò)竹葉黃酮的純化方法，郭雪峰等得到至少50%的總黃 酮，專(zhuān)利采用乙醇提取，石油醚或乙醚去脂處理，大孔樹(shù)脂柱分離，超濾膜和納濾膜截留大 分子物質(zhì)，最后得竹葉黃酮粗提物。王成章等采用HPLC法從30種竹葉中篩選黃酮含量高 的竹種作為生產(chǎn)原料，Ci?C3醇提取，濃縮，陶瓷膜、超濾膜和納濾膜過(guò)濾，再經(jīng)大孔樹(shù)脂純 化后得黃酮含量達(dá)40%?65%竹葉黃酮提取物。
[0007] 隨著竹葉黃酮成分的明確，其應(yīng)用價(jià)值也得到學(xué)者們的關(guān)注，主要應(yīng)用在食品，醫(yī) 藥保健，化妝品等行業(yè)。通過(guò)對(duì)國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利的搜索，已有諸多專(zhuān)利對(duì)黃酮有效成分加以提 取并利用。張英將適量竹葉黃酮添加到啤酒中，生產(chǎn)出竹啤飲料，不僅保留了啤酒的營(yíng)養(yǎng)價(jià) 值和口味，還具有促進(jìn)身體微循環(huán)，降低血脂等多重保健功能，同時(shí)帶有典型的竹子清香。 也有用竹葉黃酮開(kāi)發(fā)血栓性疾病預(yù)防或治療的藥物或保健品。此外，胡林福和陳永健結(jié)合 膜處理工藝，將竹葉黃酮用于飼料添加劑，保健食品原料，食品添加劑，醫(yī)藥中間體和化妝 品原料的收集，這些產(chǎn)品具有提取率高、工藝流程簡(jiǎn)單、產(chǎn)品純度高等特點(diǎn)。劉志河和李偉 試圖將竹葉黃酮類(lèi)物質(zhì)加入口腔清潔護(hù)理產(chǎn)品中，不但可去除異味，還具有消炎抑菌，防治 口腔疾病之功效，此外對(duì)口腔中的潰瘍面有一定的修復(fù)作用。可見(jiàn)竹葉黃酮對(duì)人類(lèi)健康具 有十分重要的作用。
[0008] 竹葉在我國(guó)具有悠久的食用和藥用歷史，近年來(lái)對(duì)竹葉資源化學(xué)利用的研宄也在 逐年增多，但在竹葉提取物方面的研宄依舊有不足之處，需要進(jìn)一步深入研宄。
[0009] 目前，以竹葉四種黃酮碳苷（葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和異牡荊苷）為對(duì)象進(jìn)行 的提取純化工藝的優(yōu)化還比較少，純度相對(duì)較低，還沒(méi)有實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 針對(duì)目前存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種毛竹葉中四種黃酮碳苷提取和純化工藝， 以毛竹為研宄對(duì)象，以四種黃酮碳苷的得率為指標(biāo)，對(duì)毛竹葉四種黃酮碳苷提取和純化工 藝進(jìn)行優(yōu)化，使得在優(yōu)化條件下，四種黃酮碳苷的提取率和純度都最高，可以用作醫(yī)藥中間 體或功能性保健食品開(kāi)發(fā)的原料，為實(shí)現(xiàn)黃酮碳苷的工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。
[0011] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的一個(gè)技術(shù)方案是：
[0012] 毛竹葉中四種黃酮碳苷提取和純化工藝，所述的四種黃酮碳苷為葒草苷、異葒草 苷、牡荊苷和異牡荊苷，包括如下步驟：
[0013] (1)準(zhǔn)確稱(chēng)取毛竹葉粉末，加入乙醇水溶液中進(jìn)行熱回流提取，重復(fù)提取4次， 過(guò)濾并將濾液合并得提取液；所述熱回流提取的工藝為：70%?80%的乙醇，料液比為 1 : 15?1 : 25,60?80°〇恒溫水浴提取1?311;
[0014] (2)采用減壓蒸餾法除去提取液中的有機(jī)溶劑，加入與提取液等體積的石油醚萃 取，除去色素和脂溶性成分，重復(fù)萃取三次，得到毛竹葉黃酮粗提物，石油醚回收，循環(huán)使 用；
[0015] (3)經(jīng)聚酰胺樹(shù)脂再次進(jìn)行純化處理：將毛竹葉黃酮粗提物經(jīng)大孔樹(shù)脂進(jìn)行純化 處理：大孔樹(shù)脂進(jìn)行預(yù)處理，將毛竹葉黃酮粗提物上大孔樹(shù)脂柱，濕法裝柱，加入IOmg 竹葉黃酮粗提液，控制流速3BV*h'大孔樹(shù)脂與樣品上樣量比為5 : 1，收集樣品流出液， 流出液重復(fù)上柱3次后，用15 %乙醇溶液以4BV?IT1的流速初步洗脫除雜，濃縮洗脫液， 然后用60 %的乙醇溶液以4BV?IT1流速洗脫，最后收集60 %乙醇洗脫液，濃縮并冷凍干燥 得純化后毛竹葉黃酮干粉；
[0016] (4)將上述大孔樹(shù)脂純化后的竹葉黃酮粉末，溶解后，將聚酰胺樹(shù)脂濕法裝柱于 2cmX35cm層析柱中，裝柱高度為12. 5cm，加入IOmg?ml/1上述竹葉黃酮干粉配制的溶液， 控制3BV 流速過(guò)柱，收集流出液，重復(fù)上柱3次，再用蒸餾水洗脫，收集洗脫液，濃縮，接 著用等體積40%乙醇溶液洗脫，最后收集40 %乙醇洗脫液，濃縮并冷凍干燥得純化后的竹 葉黃酮干粉。
[0017] 上述毛竹葉中四種黃酮碳苷提取和純化工藝中，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)篩選，所述熱回流提取 的工藝優(yōu)選為：75%乙醇、料液比I: 20、70°C下恒溫水浴提取2h。
[0018] 上述毛竹葉中四種黃酮碳苷提取和純化工藝中，所述的大孔樹(shù)脂為ADS-17、DM130 或D101，優(yōu)選為D101。
[0019] 上述毛竹葉中四種黃酮碳苷提取和純化工藝中，所述聚酰胺樹(shù)脂的粒徑為 0. 15 ?0. 25mm。
[0020] 上述毛竹葉中四種黃酮碳苷提取和純化工藝中，在經(jīng)大孔樹(shù)脂或聚酰胺樹(shù)脂進(jìn)行 純化處理前，對(duì)大孔樹(shù)脂或聚酰胺樹(shù)脂進(jìn)行預(yù)處理，具體如下：
[0021] 用無(wú)水乙醇洗去細(xì)小樹(shù)脂及雜質(zhì)，然后