一種麻蝦抗氧化肽及其分離提取方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種麻蝦抗氧化肽及其分離提取方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]自由基是人體新陳代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生的一類(lèi)具有高度氧化活性的有害物質(zhì)。在正常情況下，機(jī)體的免疫系統(tǒng)能夠及時(shí)地清除自由基，維護(hù)機(jī)體正常的新陳代謝。但在某些病理情況下，自由基會(huì)大量產(chǎn)生并對(duì)人體的破壞。氧自由基可使核酸、蛋白、膜多聚不飽和脂肪酸(PUFA)引起超氧化反應(yīng)、引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞等?？茖W(xué)研宄表明，人體許多病態(tài)表現(xiàn)都與自由基的產(chǎn)生息息相關(guān)，如人體的衰老、氧化性疲勞、炎癥和免疫力下降等。因此抗氧化劑的研宄越來(lái)越被人們所重視。
[0003]抗氧化肽作為一種天然、安全、高效的抗氧化劑，已成為科學(xué)研宄的熱點(diǎn)。目前抗氧化肽主要來(lái)自植物和動(dòng)物。植物的抗氧化肽主要來(lái)自大豆、核桃和花生等。在近幾年，動(dòng)物抗氧化肽，特別是海洋動(dòng)物越來(lái)越成為研宄的熱點(diǎn)。發(fā)明申請(qǐng)專(zhuān)利(申請(qǐng)?zhí)?01310196355.8)公開(kāi)了一種青養(yǎng)抗氧化肽，并測(cè)定其氨基酸序列為L(zhǎng)eu-Lys和Phe-Lys，并通過(guò)氧自由基吸收能力，得出兩種青養(yǎng)抗氧化肽是其粗肽的7.83倍和15.78倍。發(fā)明申請(qǐng)專(zhuān)利(申請(qǐng)?zhí)?01410040473.4)公開(kāi)了一種具有抗氧化活性的合浦珠母貝肉抗氧化肽，氨基酸序列為Gly-Ala-Gly-Leu-Pro-Gly-Lys-Arg-Glu-Arg，并通過(guò)還原力、DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率和超氧陰離子清除率的抗氧化指標(biāo)證明合浦珠母貝肉抗氧化肽具有很強(qiáng)的抗氧化性。
[0004]麻蝦作為一種豐富的海產(chǎn)品的資源，不僅肉質(zhì)鮮美，含有豐富的蛋白質(zhì)，同時(shí)具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，含有豐富的生物活性物質(zhì)。目前，蝦肉主要用于食用，如制作蝦仁，其余蝦的下腳料用于飼料。但對(duì)蝦活性肽方面的開(kāi)發(fā)較少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決以上現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足之處，本發(fā)明的首要目的在于提供一種麻蝦抗氧化肽。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供上述麻蝦抗氧化肽的分離提取方法。
[0007]本發(fā)明的再一目的在于提供上述麻蝦抗氧化肽的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0009]—種麻好抗氧化肽，所述抗氧化肽具有Gly-Phe-Trp的氨基酸序列。
[0010]上述麻蝦抗氧化肽的分離提取方法，包括以下操作步驟:
[0011](I)將麻蝦打成漿狀，然后與水按質(zhì)量比為1:(0.5?5)混合，加入蛋白酶酶解I?6h，滅酶，冷卻，上清液濃縮干燥，得到麻蝦酶解液粉末；
[0012](2)將麻蝦酶解液粉末采用弱極性樹(shù)脂進(jìn)行分離，依次用蒸餾水、體積分?jǐn)?shù)為10%?29%、30%?49%、50%?69%及70 %?89 %的乙醇溶液梯度洗脫，收集10%?29%的乙醇溶液洗脫組分進(jìn)行冷凍干燥處理，得到肽粉B ;
[0013](3)將肽粉B用葡聚糖凝膠色譜柱分離，以蒸餾水為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，按洗脫的時(shí)間先后依次得到三個(gè)組分，收集第三個(gè)組分冷凍干燥，得到肽粉B3 ;
[0014](4)將肽粉B3采用反相高效液相色譜進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，A相-B相為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，其中A相為乙腈，B相為體積分?jǐn)?shù)為0.1%?0.2%的三氟乙酸水溶液，按洗脫的時(shí)間先后依次得到兩個(gè)組分，收集第二個(gè)組分冷凍干燥處理，得到氨基酸序列為Gly-Phe-Trp的麻蝦抗氧化肽。
[0015]步驟(I)中所述的蛋白酶為木瓜蛋白酶或胰酶中的一種或兩種，蛋白酶添加量為500?5000U/g原料；所述酶解的pH為6.5?8.0，酶解溫度為45?55°C。
[0016]步驟(I)中所述的滅酶是指在85?100°C下保溫10?30min。
[0017]步驟⑵中所述的弱極性樹(shù)脂優(yōu)選XAD-16樹(shù)脂。
[0018]步驟(3)中所述的葡聚糖凝膠色譜柱優(yōu)選Sephadex G_15葡聚糖凝膠色譜柱。
[0019]步驟(4)中所述的分離純化條件為:色譜柱為XBridge? pre C18柱，洗脫程序?yàn)?0-7min內(nèi)采用A相體積分?jǐn)?shù)為5% ;7_12min內(nèi)A相體積分?jǐn)?shù)逐漸增加至38% ；12-20min內(nèi)A相體積分?jǐn)?shù)逐漸增加至55%，20-25min內(nèi)A相體積分?jǐn)?shù)逐漸增加至90%，25_30min A相的體積分?jǐn)?shù)為90%。
[0020]上述麻蝦抗氧化肽在食品、化妝品和醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
[0021]通過(guò)本發(fā)明的制備方法及所得到的產(chǎn)物具有如下優(yōu)點(diǎn)及有益效果:
[0022](I)目前，蝦肉主要用于食用，如制作蝦仁，其余蝦的下腳料用于飼料。但對(duì)蝦活性肽方面的開(kāi)發(fā)較少，本發(fā)明通過(guò)酶解分離純化得到的麻蝦肽，作為一種抗氧化肽，提高蝦的利用價(jià)值；
[0023](2)本發(fā)明制備的抗氧化肽具有很強(qiáng)的抗氧化活性，其氧自由基吸收能力為麻蝦酶解液粉末的10倍以上，可以作為功能性成分，用于食品、化妝品和藥品領(lǐng)域；
[0024](3)本發(fā)明制備的抗氧化肽為三肽，分子量為408.1798Da，可以被人體直接吸收。
【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1為實(shí)施例5的S印hadexG-15葡聚糖凝膠色譜柱分離后得到的三個(gè)組分的吸光度；
[0026]圖2為實(shí)施例5的反相高效液相色譜柱XBridge? prep C18柱分離的兩個(gè)組分的譜圖；
[0027]圖3為實(shí)施例5的麻蝦抗氧化肽的氨基酸序列的質(zhì)譜分析圖；
[0028]圖4為實(shí)施例5的麻蝦酶解液和樹(shù)脂XAD-16分離得到的五個(gè)組分的抗氧化活性測(cè)定圖。
[0029]圖5為實(shí)施例5的S印hadexG-15葡聚糖凝膠色譜柱分離后得到的三個(gè)組分的抗氧化活性測(cè)定圖；
[0030]圖6為實(shí)施例5的反相高效液相色譜柱XBridge? prep C18柱分離得到的兩個(gè)組分的抗氧化活性測(cè)定圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0032]實(shí)施例1
[0033](I)將麻蝦打成漿狀，再與水按質(zhì)量比1:0.5混合，加入木瓜蛋白酶，酶添加量為5000U/g原料，酶解pH為8.0，酶解溫度為45°C的條件下酶解Ih ;然后在85°C的水中保溫30min滅酶，冷卻，取上清液，濃縮，噴霧干燥得到麻蝦酶解液粉末，酶解液的水解度為21.3±0.4% ；
[0034](2)得到的麻蝦酶解液粉末首先采用弱極性樹(shù)脂XAD-16，通過(guò)蒸餾水和體積分?jǐn)?shù)為10 %、30 %、50 %及70 %的乙醇溶液對(duì)麻蝦酶解液粉末進(jìn)行濃度梯度洗脫，收集10 %的乙醇溶液洗脫組分進(jìn)行冷凍干燥處理，得到肽粉B ;
[0035](3)將步驟⑵得到的肽粉B進(jìn)行凝膠色譜葡聚糖凝膠Sephadex G_15柱層析分離純化，以蒸餾水為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，按洗脫的時(shí)間先后依次得到三個(gè)組分，收集第三個(gè)組分進(jìn)行冷凍干燥處理，得到肽粉B3 ;
[0036](4)將步驟(3)得到的肽粉B3，采用反相高效液相色譜進(jìn)行進(jìn)一步純化，按洗脫的時(shí)間先后依次得到兩個(gè)組分，收集第二個(gè)組分冷凍干燥處理，得到肽粉B3-1I ;其中色譜純化條件為:色譜柱為XBridge? pre C18柱，流動(dòng)相為A相-B相，所述A相為乙腈，B相為體積分?jǐn)?shù)為0.1%的三氟乙酸水溶液。洗脫程序?yàn)?0-7min內(nèi)采用A相體積分?jǐn)?shù)為5% ;7_12min內(nèi)A相體積分?jǐn)?shù)逐漸增加至38%;12-20min內(nèi)A相體積分?jǐn)?shù)逐漸增加至55%，20_25min內(nèi)A相體積分?jǐn)?shù)逐漸增加至90%，25-30min內(nèi)A相的體積分?jǐn)?shù)為90%。
[0037]本實(shí)施得到的麻蝦抗氧化肽，即肽粉B3-1I，通過(guò)UPLC-MS-MS測(cè)定肽的分子量為408.1798Da 和氨基酸序列為 Gly-Phe-Trp。
[0038]實(shí)施例2
[0039](I)將麻蝦打成漿狀，再與水按質(zhì)量比1:5混合，加入胰酶，酶添加量為500U/g原料，酶解PH為7.0，酶解溫度為55°C的條件下酶解6h ;然后在100°C的水中保溫1min滅酶，冷卻，取上清液，濃縮，噴霧干燥得到麻蝦酶解液粉末，酶解液的水解度為19.4±0.3% ；
[0040](2)得到的麻蝦酶解液粉末首先采用弱極性樹(shù)脂XAD-16，通過(guò)蒸餾水和體積分?jǐn)?shù)為29 %、49 %、69 %及89 %的乙醇溶液對(duì)麻蝦酶解液粉末進(jìn)行濃度梯度洗脫，收集29 %的乙醇溶液洗脫組分進(jìn)行冷凍干燥處理，得到肽粉B ;
[0041](3)將步驟(2)得到的肽粉B進(jìn)行凝膠色譜葡聚糖凝膠Sephadex G_15柱層析分離純化，以蒸餾水為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，按洗脫的時(shí)間先后依次得到三個(gè)組分，收集第三個(gè)組分進(jìn)行冷凍干燥處理，得到肽粉B3 ;
[0042](4)將步驟(3)得到的肽粉B3，采用反相高效液相色譜進(jìn)行進(jìn)一步純化，按洗脫的時(shí)間先后依次得到兩個(gè)組分，收集第二個(gè)組分冷凍干燥處理，得到肽粉B3-1I ;其中色譜純化條件為:色譜柱為XBridge? pre C18柱，流動(dòng)相為A相-B相，所述A相為乙腈，B相為體積分?jǐn)?shù)為0.2%的三氟乙酸水溶液。洗脫程序?yàn)?0-7min內(nèi)采用A相體積分?jǐn)?shù)為5% ;7_12min內(nèi)A相體積分?jǐn)?shù)逐漸增加至38%;12-20min內(nèi)A相體積分?jǐn)?shù)逐漸增加至55%，20_25min內(nèi)A相體積分?jǐn)?shù)逐漸增加至90%，25-30min內(nèi)A相的體積分?jǐn)?shù)為90%。
[0043]本實(shí)施得到的麻蝦抗氧化肽，即肽粉B3-1I，通過(guò)UPLC-MS-MS測(cè)定肽的分子量為408.1798Da 和氨基酸序列為 Gly-Phe-Trp。
[0044]實(shí)施例3
[0045](I)將麻蝦打成漿狀，再與水按質(zhì)量比1:2混合，加入木瓜蛋白酶和胰酶的混合酶，酶添加量為2000U/g原料，酶解pH為6.5，酶解溫度為50°C的條件下酶解4h ;然后在900C的水中保溫20min滅酶，冷卻，取上清液，濃縮，噴霧干燥得到麻蝦酶解液粉末，酶解液的水解度為20.9±0.3% ;
[0046](2)得到的麻蝦酶解液粉末首先采用弱極性樹(shù)脂XAD-16，通過(guò)蒸餾水和體積分?jǐn)?shù)為15 %、35 %、55 %及75 %的乙醇溶液對(duì)麻蝦酶解液粉末進(jìn)行濃度梯度洗脫，收集15 %的乙醇溶液洗脫組分進(jìn)行冷凍干燥處理，得到肽粉B ;
[0047](3)將步驟⑵得到的肽粉B進(jìn)行凝膠色譜葡聚糖凝膠S^hadex G_15柱層析分離純化，以蒸餾水為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，按洗脫的時(shí)間先后依次得到三個(gè)組分，收集第三個(gè)組分進(jìn)行冷凍干燥處理，得到肽粉B3 ;
[0048](4)將步驟(3)得到的肽粉B3，采用反相高效液相色譜進(jìn)行進(jìn)一步純化，按洗脫的時(shí)間先后依次得到兩個(gè)組分，收集