一種與植物抗逆性相關蛋白及其編碼基因GsEARLI17與應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術領域，具體為一種與植物抗逆性相關蛋白及其編碼基因 GsEARLI17 與應用。
【背景技術】
[0002] 鹽堿脅迫是影響農作物生產的主要因素之一，嚴重影響作物的產量與質量，是制 約我國農業(yè)生產和亟待解決的重大問題。目前對野生大豆等植物耐鹽堿方面的研究還多以 NaCl這類中性鹽為主，針對堿脅迫的研究還很少有報道。初步研究已經證實，植物應答鹽脅 迫和堿脅迫的機理有著明顯不同，堿脅迫由于CO廣和HCO^的存在，除Na+引起的離子脅迫 和滲透脅迫的傷害外，HCCV還會使植物根部周圍的pH值升高，可以極大地影響無機鹽離子 如Na+、K+、Cl'NO3IPH2P(V的吸收、擾亂離子平衡和組織內的pH穩(wěn)態(tài)，從而對植物產生毒 害作用。

【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明的一個目的是提供一種蛋白質。
[0004] 本發(fā)明提供的蛋白質是如下a)或b)的蛋白質：
[0005]a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0006]b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加得到的且與植物抗逆性相關的蛋白質。
[0007] 本發(fā)明還提供了與上述蛋白質相關的生物材料，為下述BI)至B6)中的任一種：
[0008] BI)編碼上述所述蛋白質的核酸分子；
[0009] B2)含有BI)所述核酸分子的表達盒；
[0010]B3)含有BI)所述核酸分子的重組載體、或含有B2)所述表達盒的重組載體； [0011] B4)含有BI)所述核酸分子的重組質粒、或含有B2)所述表達盒的重組質粒；
[0012]B5)含有BI)所述核酸分子的重組菌、或含有B2)所述表達盒的重組菌、或含有 B3)所述重組載體的重組菌；
[0013]B6)含有BI)所述核酸分子的轉基因植物細胞系、或含有B2)所述表達盒的轉基因 植物細胞系、或含有B3)所述重組載體的轉基因植物細胞系。
[0014] 上述生物材料中，BI)所述核酸分子的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
[0015] 上述生物材料中，B6)所述轉基因植物細胞系不包括繁殖材料。
[0016] 本發(fā)明另一個目的是提供上述所述蛋白質或上述所述相關生物材料在提高植物 抗逆性中的應用或上述所述蛋白質或上述所述相關生物材料在增加植物角質層厚度中的 應用。
[0017] 上述應用中，所述抗逆性為抗堿脅迫。
[0018] 本發(fā)明最后一個目的是提供一種構建轉基因植物的方法。
[0019] 本發(fā)明提供的構建轉基因植物的方法包括如下步驟：使上述所述蛋白質在出發(fā)植 物中過表達，進而使植物的抗逆性提高。
[0020] 上述方法中，所述使上述所述蛋白質在受體植物中過表達的方法為：向出發(fā)植物 中導入上述所述蛋白質的編碼基因，得到轉基因植物；轉基因植物與出發(fā)植物相比，抗逆性 提1?。
[0021] 上述方法中，所述蛋白質的編碼基因序列如序列表中序列1所示。
[0022] 上述方法中，所述抗逆性為抗堿脅迫。
[0023] 上述方法中，所述出發(fā)植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述雙子葉植物具體為 擬南芥。
[0024] 本發(fā)明通過實驗證明，本發(fā)明提供的蛋白具有提高植物抗逆性的功能，該蛋白在 植物育種方面具有重要應用價值。
【附圖說明】
[0025] 圖1為野生大豆中在堿處理下GsEARLI17基因表達量的變化。圖Ia為野生大 豆中在堿處理下葉中GsEARLI17基因表達量的變化；圖Ib為野生大豆中在堿處理下根中 GsEARLI17基因表達量的變化；圖Ic為野生大豆中在鹽處理下葉中GsEARLI17基因表達量 的變化；圖Id為野生大豆中在鹽處理下根中GsEARLI17基因表達量的變化。
[0026] 圖2為轉基因擬南芥與野生型擬南芥GsEARLI17基因表達量和角質層厚度的比 較。圖2a為pMCS-GsEARLI17表達載體的構建；圖2b為轉基因擬南芥與野生型擬南芥 GsEARLI17基因表達量比較；圖2c為轉基因擬南芥與野生型擬南芥葉片角質層的厚度比 較；圖2d為轉基因擬南芥與野生型擬南芥葉片角質層的厚度在透射電鏡下的觀察比較。其 中，WT為野生型擬南芥植株；35S :GsEARLI17#8和35S :GsEARLI17#12為轉基因擬南芥植 株。
[0027] 圖3為轉基因擬南芥在種子萌發(fā)期及幼苗期對堿脅迫的響應。圖3a為轉基因擬 南芥與野生型擬南芥在堿脅迫下的種子萌發(fā)及幼苗生長情況；圖3b為轉基因擬南芥與野 生型擬南芥在堿脅迫下的種子萌發(fā)率；圖3c為轉基因擬南芥與野生型擬南芥幼苗在堿脅 迫下的展葉率。其中，WT為野生型擬南芥植株；35S :GsEARLI17#8和35S :GsEARLI17#12為 轉基因擬南芥植株。
[0028] 圖4為轉基因擬南芥成苗與野生型擬南芥成苗在堿脅迫下的生長情況。圖4a 為堿處理下的轉基因擬南芥成苗與野生型擬南芥成苗的表型；圖4b為堿脅迫下轉基因 擬南芥成苗與野生型擬南芥成苗丙二醛含量；圖4c為堿脅迫下轉基因擬南芥成苗與野 生型擬南芥成苗葉綠素含量。其中，WT為野生型擬南芥植株；35S :GsEARLI17#8和35S : GsEARLI 17#12為轉基因擬南芥植株。
[0029] 圖5為非生物脅迫相關Marker基因在野生型擬南芥和轉基因擬南芥中的堿脅迫 表達模式。圖5a為NADP-ME基因在野生型擬南芥和轉基因擬南芥中的堿脅迫表達模式；圖 5b為H+-Ppase基因在野生型擬南芥和轉基因擬南芥中的堿脅迫表達模式。WT為野生型擬 南芥植株；35S=GsEARLI17為轉基因擬南芥植株。
【具體實施方式】
[0030] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0031] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0032] 實驗材料為野生大豆G07256種子，在文獻"MingzheSun,XiaoliSun,Yang Zhao,HuaCai,ChaoyueZhao,WeiJi,HuiziDuanMu,YangYu,YanmingZhu.Ectopic expressionofGsPPCK3andSCMRPinMedicagoSativaenhancesplantalkaline stresstoleranceandmethioninecontent.PLOSONE2014,9(2) :e89578" 中公開過，公 眾可以從吉林省農業(yè)科學院或東北農業(yè)大學獲得。
[0033]pMCS載體在文獻"WangXJ,TangQL,DongL,DongYF,SuYY,JiaSR,WangZX Constructionofastandardreferenceplasmidcontainingseventargetgenesfor thedetectionoftransgeniccotton. 2014,Plasmid74:39-44?"中公開過，公眾可從東 北農業(yè)大學獲得。
[0034] 實施例1、野生大豆中耐堿相關蛋白編碼基因GsEARLI17的獲得
[0035] 一、植物材料的處理
[0036] 挑選飽滿的野生大豆G07256種子于濃H2SO4中處理IOmin以去除泥膜，倒凈濃 H2SO4，用無菌水沖洗3?4遍后放置于濕潤的濾紙上，25°C暗培養(yǎng)3d催芽，待芽長到約1? 2cm時，將其轉移到盛有30%草炭土、70%普通土的育苗盆中，放置于人工氣候箱中培養(yǎng)。 待幼苗長至3周齡，迅速取新鮮葉片及根尖3cm混合，置于-80°C保存。
[0037] 二、植物總RNA的提取
[0038]RNA提取具體步驟參見TIANGEN公司RNApreppure試劑盒說明書。
[0039] 三、cDNA第一鏈的合成
[0040] 以OligodT為引物進行cDNA第一條鏈的合成，方法參見Invitrogen公司 SuperScript?IIIReverseTranscriptase說明書。
[0041] 四、目的基因GsEARLI17的擴增
[0042]以野生大總cDNA為模板，米用GsEARLI17sense和GsEARLI17antisense引物進 行PCR擴增，得到GsEARLI17基因。引物序列如下：
[0043] GsEARLI17sense:5' -ATGGAGTCTTCTAGAACTT-3' ；
[0044]GsEARLII7antisense:5, -CTAGTTGCACAGGAAGTCA-3，。
[0045]PCR反應體系：20iiL5XPrimeSTAR?HSPCR緩沖液，8iiLdNTP混合物（A、G、 T、C各 2. 5mM)，2iiL上下游引物（10iiM)，IiiL