一種重組抗菌肽及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種重組抗菌肽及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 經(jīng)過2億年的進(jìn)化，母乳喂養(yǎng)以及其獨(dú)特的產(chǎn)物母乳依然哺育保護(hù)著新生的嬰 兒。母乳中大量的蛋白對致病菌、病毒和真菌具有抑制作用。其中一些蛋白可以單獨(dú)發(fā)揮 作用，而另一些蛋白則必須協(xié)同發(fā)揮作用。多種成分作用于同一種病原菌貌似是一種冗余， 其實(shí)際是一種多重保護(hù)系統(tǒng)。體內(nèi)蛋白酶的水解作用產(chǎn)生了大量的母乳多肽，這些母乳多 肽除了提供氨基酸作為營養(yǎng)還發(fā)揮作用的生理功能。進(jìn)一步研宄發(fā)現(xiàn)大量的母乳多肽展現(xiàn) 出多重的抗微生物作用，為新生提供免疫保護(hù)。
[0003] 隨著抗生素的大量應(yīng)用，細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生和新生抗生素的篩選瓶頸使得抗生素 的應(yīng)用受到一定的制約。近年來的研宄發(fā)現(xiàn)，抗菌肽（Antimicrobalpeptides,AMPs)以其 獨(dú)特的作用機(jī)理和分子特性成為有望替代傳統(tǒng)抗生素的理想藥物。作為一種新型抗菌物 質(zhì)，AMP有著廣譜抗菌活性，能快速殺死細(xì)菌，且對一些臨床相關(guān)的可導(dǎo)致嚴(yán)重感染的病原 體及耐藥菌株有效。母乳作為重要資源，含有豐富的具有潛在抗菌功能的多肽成為大家研 宄的對象。
[0004] 我們借助超濾技術(shù)分離出母乳中小于IOKDa的多肽成分，進(jìn)一步借助串聯(lián)質(zhì)譜技 術(shù)對其具體組成進(jìn)行鑒定分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些多肽主要是從人0-酪蛋白（Homosapiens betacasein，基因Bank號：NM_001891)中斷裂下來的片段，天然存在于母乳中?，F(xiàn)有技術(shù) 中沒有對這些片斷及其功能進(jìn)一步研宄的報(bào)道，為此，我們篩選了一些多肽進(jìn)行深入的研 宄。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對上述技術(shù)問題提供一種重組抗菌肽。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述重組抗菌肽的制備方法。
[0007] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供上述重組抗菌肽的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0009] -種重組抗菌肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。命名為Casein41。
[0010] 表達(dá)上述抗菌肽的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
[0011] 所述多肽的擴(kuò)增引物，其中上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，下游引物 的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。
[0012] 所述抗菌肽的制備方法，該方法包括下列步驟：
[0013] a.構(gòu)建上述多肽的表達(dá)載體pSUMO;
[0014] b.pSUMO融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)；
[0015] c.pSUMO融合蛋白的純化、收集；
[0016] d.重組抗菌肽的純化、收集。
[0017] 所述的制備方法，該方法包括以下步驟：
[0018]a.構(gòu)建上述多肽（SEQIDNO:1)的表達(dá)載體pSUMO:
[0019] 人工合成該多肽核酸序列，利用上述的上下游引物通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出含有 Bsal、HindIII酶切位點(diǎn)的該多肽核酸片段進(jìn)行膠回收，回收產(chǎn)物雙酶切后載入pSUMO載 體；
[0020] b.pSUMO融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)：
[0021] 1)測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21，接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)液培養(yǎng)；
[0022] 2)收集菌體，重懸后加入IPTG誘導(dǎo)pSUMO融合蛋白表達(dá)；
[0023] c.pSUMO融合蛋白的純化：
[0024] 誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液沉淀用Ni-NTABinding-Buffer重懸后，超聲破碎，離心，取上 清，上清液上樣至Ni-NTA親和層析柱，洗脫pSUMO融合蛋白，收集洗脫液，SDS-PAGE電泳分 析；
[0025] d.重組抗菌肽的純化、收集：
[0026] 采用SUMO酶對pSUMO融合蛋白進(jìn)行酶切，利用Ni-NTA親和層析柱去除SUMO標(biāo)簽 或沒有被切割的SUMO融合蛋白，洗脫重組抗菌肽，電泳分析，收集重組抗菌肽。
[0027] 所述的重組抗菌肽在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。所述的抗菌藥物所針對的病菌為致 病菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌和表皮葡萄球菌。
[0028] 本發(fā)明的有益效果：
[0029] 本發(fā)明提供的多肽具有較好的抗病菌作用，可用于制備抗菌的藥物。
[0030] 本發(fā)明提供的多肽也可以通過化學(xué)合成得到，但是合成的成本高，且不利于大規(guī) 模生產(chǎn)制備。因此，本發(fā)明還提供了該多肽的基因重組技術(shù)制備方法，該制備方法簡單易 行，成本低，易于產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。
[0031]由于SUMO除了具有傳統(tǒng)融合標(biāo)簽的促進(jìn)可溶性的特性外，還具有分子伴侶功能， 能促進(jìn)目的蛋白的正確折疊等特點(diǎn)，同時(shí)對熱和蛋白酶有很強(qiáng)的抗性，有利于保持目的蛋 白的穩(wěn)定性。本研宄中我們成功構(gòu)建了多肽與SUMO融合表達(dá)載體，并對其表達(dá)條件進(jìn)行了 優(yōu)化表，融合蛋白經(jīng)SUMO酶酶切、柱純化后可大量獲取可溶性多肽，與化學(xué)合成比大大降 低了獲取多肽的成本。
[0032] 隨著抗生素的大量使用，細(xì)菌產(chǎn)生廣泛的耐藥性。本發(fā)明中抗菌肽對青霉素耐藥 金黃色葡萄球菌和頭孢菌素耐藥肺炎克雷伯菌均具有殺傷作用。因此，有望成為替代傳統(tǒng) 抗生素的理想替代藥物。
【附圖說明】
[0033]圖I:SUM0融合蛋白SDS-PAGE。
[0034] 其中：M:蛋白Marker;1 :破碎上清；2 :流出液；3 :洗滌液；4 :洗脫液。
[0035] 圖2 :切割后純化后的重組多肽Tricine/SDS-PAGE電泳。
[0036] 其中:蛋白Marker;2:切割后的重組多肽。
[0037] 圖3 :重組抗菌肽對金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌耐藥菌的殺傷活性。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。
[0039] 實(shí)施例1
[0040] 1.該多肽具有一下的序列特征：
[0041]氨基酸序列：ELLLNPTHQIYPVTQPLAPVHNPIS(SEQIDNO:1)
[0042] 核苷酸序列：
[0043] GAACTTCTACTTAACCCCACCCACCAGATCTACCCTGTGACTCAGCCACTTGCCCCAGTTCATAACCCC ATTAGT(SEQIDNO：2)
[0044] 具有等電點(diǎn)（pi) :5. 99,分子量（Mw) :2792. 23。
[0045] 2.重組制備方法的建立
[0046] 2. 1載體構(gòu)建：
[0047] 人工合成該多肽核酸序列，借助PCR技術(shù)利用下面引物：
[0048] NOl-F：CATATCGGTCTCGAACTTCTACTTAACCCCA(SEQIDNO：3)
[0049]BsaI
[0050] NOl-R：CCCAAGCTTACTAATGGGGTTATGAACTG(SEQIDNO：4)
[0051] HindIII
[0052] 擴(kuò)增出含有上述酶切位點(diǎn)的該多肽核酸片段進(jìn)行膠回收，回收產(chǎn)物雙酶切后載入 pSUMO載體（Lifesensors，USA)，轉(zhuǎn)入DH5a感受態(tài)細(xì)胞，抽取質(zhì)粒后送公司測序。
[0053]2. 2pSUMO融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
[0054] 1.測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)涂板，挑取轉(zhuǎn)化平板上的單克隆接種 于含30yg/mlKan(卡那霉素）的3mlLB培養(yǎng)液的試管中，37°C200rpm振搖過夜；
[0055] 2.次日按1 :100接種于30yg/ml卡那霉素的50mlLB培養(yǎng)液中，37°C200rpm振 搖至菌體0D600為0. 6 (約2. 5h);
[0056] 3.取出200y1培養(yǎng)物，12000g室溫離心2min，棄上清，用20yI2X上樣緩沖液 (0? 5MNaCl，20mMTris, 20mM咪唑）重懸菌體沉淀；
[0057] 4.向剩余的培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為0.2mmol/l，25°C220rpm振搖6h，誘導(dǎo) pSUMO融合蛋白（命名為pSUMO-NO: 1融合蛋白）表達(dá)；
[0058] 5.取出200y1培養(yǎng)物，12000g室溫離心3min，棄上清，用20yI2X上樣緩沖液 重懸菌體沉淀，剩余培養(yǎng)物4°C5000g離心20min，棄上清，置-80°C凍存。
[0059] 2. 3pSUMO融合蛋白的純化
[0060]