.本發(fā)明雖然保留在CNTF第17位的半胱氨酸，但對(duì)于經(jīng)過定點(diǎn)突變的睫狀神經(jīng) 營(yíng)養(yǎng)因子突變體的生物學(xué)活性沒有影響，因此，可以用于修飾現(xiàn)有技術(shù)中證明有效的睫狀 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子突變體，以獲得修飾均一的修飾型睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。
[0030] 4.本發(fā)明的化學(xué)修飾劑（例如mPEG-MAL)安全可靠，已通過了美國(guó)的FDA認(rèn)證，可 以用于食品、醫(yī)藥、化妝品等廣泛的領(lǐng)域中。
[0031] 5.本發(fā)明的睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子突變體、以及修飾型睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子突變體的具 有顯著的抑制體重增長(zhǎng)的效果，最為顯著的是修飾型睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子突變體與未修飾型 的睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子突變體相比較具有明顯的長(zhǎng)效作用，從而能達(dá)到治療或預(yù)防肥胖癥及 其相關(guān)疾病的顯著效果。
【附圖說明】
[0032] 圖1為CNTF突變體表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖；
[0033] 圖2為CNTFnew/CC22的編碼序列PCR鑒定圖，其中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DNA Marker) ;1為陰性對(duì)照；2-9分別為隨機(jī)挑選的8個(gè)CNTFnew/CC22工程菌的菌落的結(jié)果；
[0034]圖3為NedI和EcorI雙酶切鑒定的結(jié)果圖，其中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-8分別 為隨機(jī)挑選的8個(gè)CNTFnew/CC22工程菌菌落的結(jié)果；9為陰性對(duì)照；
[0035] 圖4為CNTFnewCC22的全基因序列測(cè)定結(jié)果圖；
[0036] 圖5為目的蛋白CNTFnew/CC22的表達(dá)結(jié)果圖，其中，M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn) (ProteinMarker) ;1為陰性對(duì)照；2-9分別為隨機(jī)挑選的8個(gè)CNTFnew/CC22工程菌菌落的 結(jié)果；
[0037] 圖6為CNTFnew/CC22蛋白SDS-PAGE電泳圖，其中左道為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，右道 為CNTFnew/CC22 蛋白；
[0038] 圖7為CNTFnew/CC22蛋白的N端15個(gè)氨基酸序列的序列比對(duì)圖；
[0039] 圖8為CNTFnew/CC22蛋白免疫印跡電泳圖，其中左道為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，右道 為CNTFnew/CC22蛋白的結(jié)果；
[0040] 圖9為CNTFnew/CC22蛋白與MAL-mPEG分子結(jié)合的示意圖；
[0041] 圖10為直鏈和支鏈的MAL-mPEG修飾CNTFnew/CC22蛋白電泳圖，其中，M為蛋 白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為Y-MAL-40K修飾后的CNTFnew/CC22蛋白；2為M-MAL-20K修飾后的 CNTFnew/CC22 蛋白；
[0042] 圖11為純化后的直鏈和支鏈的MAL-mPEG修飾CNTFnew/CC22蛋白電泳圖，其中，M 為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為CNTFnew/CC22蛋白M-MAL-20K修飾后純化結(jié)果；2為CNTFnew/ CC22蛋白Y-MAL-40K修飾后純化結(jié)果；
[0043] 圖12為聚乙二醇修飾后產(chǎn)物經(jīng)QFF純化層析結(jié)果圖；
[0044] 圖13為QFF洗脫峰的凝膠過濾分析（Superdex200,GEHealthcare)圖；其中，QFF 純化修飾后產(chǎn)物洗脫峰收集物Pl、P2、P3,線性洗脫第一個(gè)峰稱為Pl，為單修飾產(chǎn)物，線性 洗脫第二個(gè)峰稱為P2,線性洗脫第三個(gè)峰稱為P3,詳見圖13。
[0045] 圖14為原蛋白及單修飾產(chǎn)物的反相HPLC分析結(jié)果圖（采用的是資生堂的C18反 相柱，洗脫梯度為5%-95%，洗脫時(shí)間為60分鐘。檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm)。其中，左圖為原蛋 白；右圖為修飾樣品；
[0046] 圖15為單修飾產(chǎn)物的SDS-PAGE分析（6 %指的是分離膠中聚丙烯酰胺的 濃度），其中，左側(cè)泳道為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；右側(cè)泳道為純化后的CNTF修飾后產(chǎn)物 Y-MAL-40K-CC22；
[0047] 圖16為原蛋白CNTFnew/CC22胰蛋白酶酶切樣品的反相HPLC分析圖譜；
[0048] 圖17為Y-MAL-40K胰蛋白酶酶切樣品的反相HPLC分析圖譜；
[0049] 圖18分別為CNTFnew/CC22和Y-MAL-40K-CC22中m/z593的提取離子流圖（上面 兩圖）和一級(jí)質(zhì)譜圖（下面兩圖）。
【具體實(shí)施方式】
[0050] 以下通過【具體實(shí)施方式】的描述并參照附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但這并非是對(duì) 本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進(jìn)，但是只 要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0051] 本發(fā)明的目的在于提供一種睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子突變體與一種修飾型睫狀神經(jīng)營(yíng) 養(yǎng)因子，以在提高睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的治療效果的前提下，獲得的修飾后性狀均一的修飾 型的睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。
[0052] -直以來人們認(rèn)為CNTF或CNTF突變體的氨基酸序列第17位的半胱氨酸容易與 其他CNTF或CNTF突變體形成二硫鍵，偶聯(lián)形成二聚體而影響其生物學(xué)活性；因此，人們?yōu)?了獲得穩(wěn)定的CNTF突變體會(huì)首先選擇將第17位的半胱氨酸替換為更不易形成二硫鍵的丙 氨酸或絲氨酸。但是通過對(duì)CNTF氨基酸序列（SEQIDNO:1)的系統(tǒng)分析與設(shè)計(jì)以及大量 的試驗(yàn)中，本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)在使用PEG或PEG類聚合物對(duì)CNTF或CNTF突變體修飾時(shí)， 有意地選擇保留CNTF或CNTF突變體的氨基酸序列第17位的半胱氨酸，不僅可以提高治療 效果的同時(shí)，而且能夠獲得的修飾后性狀均一的修飾型的睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。
[0053] 本發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，即使保留了CNTF突變體的氨基酸序列第17位的 半胱氨酸的情況下，使用突變CNTF的方法，如將第63位谷氨酰胺突變成精氨酸、去除C末 端第1-30個(gè)氨基酸等，也不會(huì)影響CNTF突變體在進(jìn)一步化學(xué)修飾中的穩(wěn)定，即在與化學(xué)修 飾劑結(jié)合過程中，CNTF突變體的第17位的半胱氨酸不會(huì)與CNTF或CNTF突變體相結(jié)合而 形成共聚物或二聚體，相反地，其會(huì)與化學(xué)修飾劑如PEG及其PEG類聚合物相結(jié)合，形成修 飾均一的修飾型CNTF突變體。
[0054] 具體而言：
[0055] 本發(fā)明第一方面提供了一種睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子突變體，其中，所述的睫狀神經(jīng)營(yíng) 養(yǎng)因子突變體是通過在睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的氨基酸序列的基礎(chǔ)上，保留了第17位的半胱 氨酸，將第63位的谷氨酰胺突變?yōu)榫彼幔⑶胰コ薈末端的15個(gè)氨基酸而得到的。
[0056] 優(yōu)選的是，所述的睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子突變體具有SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。
[0057] 本發(fā)明第二方面提供了一種DNA，其中，所述DNA的核苷酸序列為編碼上述的睫狀 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子突變體的核苷酸序列。
[0058] 優(yōu)選的是，所述DNA的核苷酸序列為SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。
[0059] 本發(fā)明第三方面提供了一種重組表達(dá)載體，其中，所述重組表達(dá)載體含有所述DNA 的核苷酸序列。
[0060] 優(yōu)選的是，所述重組表達(dá)載體為如圖1所示的PET24a+/CNTFnew/CC22表達(dá)載體。
[0061] 本發(fā)明第四方面提供了一種遺傳工程宿主細(xì)胞，其中，所述宿主細(xì)胞含有所述的 重組表達(dá)載體。
[0062] 優(yōu)選的是，所述宿主細(xì)胞為CNTFnew/CC22工程菌。
[0063] 本發(fā)明第五方面提供了一種修飾型睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子突變體，其中，所述的修飾 型睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是通過對(duì)上述的睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子突變體的第17位半胱氨酸進(jìn)行定 點(diǎn)修飾而得到的，所述定點(diǎn)修飾是通過在所述的第17位半胱氨酸上結(jié)合化學(xué)修飾劑而實(shí) 現(xiàn)的。
[0064] 定點(diǎn)修飾的方法可采用本領(lǐng)域已知的方法，例如張霖琳等，聚乙二醇單修飾重組 人粒細(xì)胞集落刺激因子的研究，生物工程學(xué)報(bào)，2005, 2U6)中公開的方法，其在4°C條件下 將待修飾蛋白置于不同PH值的緩沖液中，以保證其生物學(xué)活性。Lowry法測(cè)定蛋白濃度，將 蛋白稀釋到實(shí)驗(yàn)所需的各個(gè)濃度，按摩爾配比（PEG:蛋白質(zhì)）加入修飾劑，混合均勻，按正 交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的溫度進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為2-16h。
[0065] 所述的化學(xué)修飾劑可以使用在蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域中常用的化學(xué)修飾劑（包括高分 子、聚合物修飾劑等），只要能夠與半胱氨酸的巰基相結(jié)合，獲得均一的修飾后產(chǎn)物即可。在 本文中，"均一"是指沒有同分異構(gòu)體，純度在95%以上。
[0066] 優(yōu)選的是，所述化學(xué)修飾劑為聚乙二醇（PEG)或聚乙二醇類聚合物。
[0067] 在本文中，所述的"聚乙二醇類聚合物"指的是聚乙二醇衍生物，在聚乙二醇的應(yīng) 用中，端基起著決定性的作用，不同端基的聚乙二醇具有不同的用途。在實(shí)際應(yīng)用中聚乙二 醇高分子鏈端不僅僅局限于帶端羥基，其它反應(yīng)性更強(qiáng)的功能化基團(tuán)，如對(duì)甲苯磺酸酯基、 氨基、羧基、醛基等亦可被引入到聚乙二醇鏈的兩端。這些功能化基團(tuán)的引入擴(kuò)大了聚乙二 醇的應(yīng)用范圍，使它在有機(jī)合成、多肽合成、高分子合成及藥物的緩釋控釋、靶向施藥等多