br>【具體實(shí)施方式】
[0032] 本發(fā)明設(shè)計(jì)并構(gòu)建了一種CD3單鏈抗體，其具有足夠的靶向性。更重要的是，此抗 體為全人源序列，可以有效地避免臨床治療應(yīng)用中的HAM發(fā)生，從而能夠更有效地減少耐 藥現(xiàn)象的發(fā)生，可以提高藥物的利用效率和治療效果。
[0033] 人體內(nèi)的天然抗體是由重鏈和輕鏈組成，其中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)對(duì)于 抗原的結(jié)合特別重要。本發(fā)明的研宄表明，由重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)組成的融合蛋白 (即單鏈抗體）仍然具有良好的抗原結(jié)合活性。此單鏈抗體分子量?jī)H約25kD，體積僅為天 然抗體的1/6,因此具有較好的組織滲透能力。天然抗體可變區(qū)是由重鏈可變區(qū)和輕鏈可變 區(qū)兩條肽鏈組成的異二聚體，而單鏈抗體是由重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)組成的融合單鏈， 可能會(huì)形成空間位阻，難以形成有效的抗原結(jié)合構(gòu)象。因此，需要在重鏈可變區(qū)和輕鏈可變 區(qū)之間引入一條柔性連接肽，從而保證單鏈抗體能夠形成正確的空間構(gòu)象，具備有效的抗 原結(jié)合活性。
[0034] 本發(fā)明的CD3單鏈抗體可以與其他蛋白進(jìn)一步融合，以達(dá)到其他額外的作用，而 不影響其靶向性。本發(fā)明在抗體的C端融合了His6標(biāo)簽蛋白，從而能夠利用金屬離子親和 層析法純化。
[0035] 本發(fā)明的CD3單鏈抗體可以與其他抗腫瘤單鏈抗體融合，所形成的抗體一方面可 以發(fā)揮靶向腫瘤細(xì)胞的作用，另一方面可以結(jié)合T淋巴細(xì)胞，從而發(fā)揮其殺傷腫瘤靶細(xì)胞 的作用。
[0036] 本發(fā)明的CD3單鏈抗體也可以與熒光或毒素分子連接，所形成的重組抗體可以診 斷和殺傷T淋巴細(xì)胞白血病等惡性腫瘤。
[0037] 本發(fā)明描述的抗體可通過(guò)常規(guī)的基因重組技術(shù)所構(gòu)建，具體實(shí)驗(yàn)步驟如《分子克 隆》第三版（JosephSambrook，科學(xué)出版社）及類似的實(shí)驗(yàn)手冊(cè)所記載。所用的⑶3單鏈 抗體編碼的核苷酸序列如SEQIDNO. 5或SEQIDNO. 7所示，氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO. 6 或SEQIDNO. 8 所示。
[0038] 上述單鏈抗體的DNA可以通過(guò)常規(guī)的基因重組技術(shù)獲得。所需編碼⑶3單鏈抗體 的DNA序列分別來(lái)源于人類抗體胚系基因。將編碼上述單鏈抗體的DNA序列用PCR獲得后 分別克隆到載體中，所用載體可以是分子生物學(xué)常用的質(zhì)粒、病毒或基因片段。在編碼上述 抗體的DNA序列前端加上蛋白分泌信號(hào)肽序列，以保證抗體能夠從細(xì)胞中分泌。載體序列 中包括用于基因表達(dá)的啟動(dòng)子、蛋白質(zhì)翻譯起始和終止信號(hào)、以及多聚腺苷酸（PolyA)序 列。載體中含有抗生素抗性基因，以利于載體在宿主細(xì)胞如細(xì)菌和真核細(xì)胞中的復(fù)制和表 達(dá)。另外，載體中還包括真核細(xì)胞選擇性基因，用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞株的選擇。
[0039] 本發(fā)明的單鏈抗體中重鏈可變區(qū)（VH)和輕鏈可變區(qū)（VL)的排列方式，可以是 VH-VL，也可以是VL-VH，它們都屬于本發(fā)明的范疇。
[0040] 本發(fā)明單鏈抗體內(nèi)部連接肽的目的在于提供更好的柔韌性，以避免結(jié)構(gòu)上的空間 位阻，因此連接肽氨基酸序列和長(zhǎng)度均可以有一定的變化，它們都屬于本發(fā)明的范疇。
[0041] 本發(fā)明單鏈抗體可以與其他效應(yīng)分子進(jìn)一步融合，以達(dá)到其他額外的作用，而不 影響其靶向性，它們都屬于本發(fā)明的范疇。
[0042] 在完成含編碼上述抗體的DNA序列的質(zhì)粒構(gòu)建以后，即可用該重組載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn) 化宿主細(xì)胞，表達(dá)相應(yīng)的蛋白質(zhì)。能夠用于表達(dá)抗體的表達(dá)系統(tǒng)有多種，可以是真核細(xì)胞， 也可以是原核細(xì)胞，它們包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、酵母、細(xì)菌等。由于原核細(xì)胞表達(dá)抗 體容易形成包涵體，因此哺乳動(dòng)物細(xì)胞是表達(dá)該蛋白的優(yōu)選系統(tǒng)?？捎糜诖笠?guī)模表達(dá)抗體 的哺乳動(dòng)物細(xì)胞有多種，例如CHO細(xì)胞、293細(xì)胞、NSO細(xì)胞、COS細(xì)胞等，它們都包括在本發(fā) 明所能使用的細(xì)胞之列。含有編碼上述抗體基因的重組質(zhì)?？山?jīng)轉(zhuǎn)染進(jìn)入宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)染 細(xì)胞的方法有多種，其中包括電穿孔法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法和磷酸鈣轉(zhuǎn)染法等。
[0043] 一種較佳的蛋白表達(dá)方法是利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞表達(dá)。例如，用含有新霉素 (Neomycin)抗性基因的重組載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染無(wú)新霉素抗性的宿主細(xì)胞后，可在細(xì)胞培養(yǎng)液中 增加新霉素的濃度以篩選出高表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株；又例如用含有二氫葉酸還原酶（DHFR) 基因的重組載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染缺乏DHFR的宿主細(xì)胞后，可在細(xì)胞培養(yǎng)液中增加氨甲喋呤（MTX) 的濃度以篩選出高表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株。
[0044] 哺乳動(dòng)物細(xì)胞以外的其他表達(dá)系統(tǒng)，例如昆蟲細(xì)胞、酵母、細(xì)菌等也可以用于表達(dá) 本發(fā)明的抗體，它們也被包含本發(fā)明所能使用的宿主細(xì)胞之列。這些表達(dá)系統(tǒng)的蛋白質(zhì)產(chǎn) 量比哺乳動(dòng)物細(xì)胞的較高，但是容易形成包涵體，因此需要進(jìn)一步蛋白復(fù)性。
[0045] 從重組體培養(yǎng)液中獲得相應(yīng)的抗體后，可以用流式細(xì)胞術(shù)和ELISA來(lái)檢測(cè)其對(duì) CD3陽(yáng)性細(xì)胞的結(jié)合活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的抗體能夠結(jié)合CD3陽(yáng)性的細(xì)胞如Jurkat 細(xì)胞或T淋巴細(xì)胞，因此本發(fā)明所構(gòu)建的抗體可以有效靶向T淋巴細(xì)胞。
[0046] 本發(fā)明的抗體還可以用病毒載體來(lái)運(yùn)載和表達(dá)，這些病毒載體包括但不限于腺病 毒載體（adenoviralvectors)、腺相關(guān)病毒載體（adeno-associatedviralvectors)、反 轉(zhuǎn)錄病毒載體（retroviral vectors)、單純皰疼病毒載體（herpes simplex virus-based vectors)、慢病毒載體（lentiviral vectors)〇
[0047] 本發(fā)明的抗體可以按照藥劑學(xué)常規(guī)技術(shù)制備成各種形式的藥物制劑，較優(yōu)選的是 注射劑，最優(yōu)選的是冷凍干燥注射劑。
[0048] 本發(fā)明的抗體可以與其他藥物形成藥物組合物，所述組合物可以和其他治療方法 一起治療疾病，所述其他治療方法包括化學(xué)療法、放射療法、生物療法。
[0049] 以下實(shí)例對(duì)本發(fā)明所涉及的單鏈抗體的構(gòu)建、試驗(yàn)和應(yīng)用作了詳細(xì)說(shuō)明。但是本 發(fā)明的內(nèi)容和用途并不僅限于實(shí)例的范疇。
[0050] 實(shí)施例一本發(fā)明單鏈抗體的DNA序列及重組載體的構(gòu)建
[0051] 本發(fā)明中編碼單鏈抗體的基因片段可以通過(guò)經(jīng)典的分子生物技術(shù)獲得，并且該基 因序列可針對(duì)哺乳表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)化，以便得到更佳的表達(dá)量。單鏈抗體基因片段與相應(yīng)的表 達(dá)載體重新連接可獲得重組載體，以適應(yīng)哺乳細(xì)胞的表達(dá)和篩選。
[0052] 本發(fā)明的人源⑶3單鏈抗體可變區(qū)的重鏈可變區(qū)（VH)和輕鏈可變區(qū)（VL)基因 是由來(lái)人類抗體胚系基因中篩選得到（見(jiàn)圖1)。VH編碼的核苷酸序列如序列表中SEQID NO. 1所示，氨基酸序列如序列表中SEQIDNO. 2所示。VL編碼的核苷酸序列如序列表中 SEQIDNO. 3所示，氨基酸序列如序列表中SEQIDNO. 4所示。本發(fā)明⑶3單鏈抗體的蛋白 空間結(jié)構(gòu)提示，重鏈可變區(qū)的3個(gè)CDR區(qū)和輕鏈可變區(qū)的3個(gè)CDR區(qū)呈明顯的環(huán)狀排列，形 成一個(gè)類似" 口袋"的結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖2)。
[0053] 本發(fā)明中表達(dá)CD3單鏈抗體的完整基因是通過(guò)合成的基因片段由拼接PCR擴(kuò)增所 得。按照VH-VL的排列方式，并在VH和VL之間插入連接肽（GGGGSGGGGSGGGGS)，可以融合 構(gòu)成本發(fā)明的⑶3單鏈抗體⑶3ScFv-VHVL(編碼核苷酸序列如序列表中SEQIDNO. 5所 示，氨基酸序列如序列表中SEQIDN0.6所示）。合成編碼小鼠免疫球蛋白kappa輕鏈（Ig kappa)的分泌信號(hào)肽基因以及編碼His6標(biāo)簽蛋白的基因，通過(guò)拼接PCR，在單鏈抗體N端 加上Igkappa信號(hào)肽，并在單鏈抗體C端加上His6標(biāo)簽，不但可以保證其分泌到哺乳細(xì)胞 夕卜，而且還能夠利用親和層析純化得到高純度的目標(biāo)蛋白。
[0054] 獲得的完整PCR基因片段插入到質(zhì)粒載體pcDNA3. 1(+)的BamHI和XhoI酶切位 點(diǎn)，從而獲得編碼CD3單鏈抗體的重組載體（見(jiàn)圖3)。
[0055] 包含本發(fā)明單鏈抗體蛋白基因的重組質(zhì)粒利用CM