一種靶向鼠t淋巴細胞cd3和人腫瘤抗原h(huán)er2的雙特異性抗體制備方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫學的技術領域。具體地說，涉及雙特異性抗體的構建和制備方法， 以及設計建立鼠腫瘤模型，并進行雙特異性抗體體外、體內藥效和機理的研宄。為雙抗體藥 物開發(fā)過程中藥物機理，特別是臨床前動物體內藥效的研宄提供有力的方法和模型。
【背景技術】
[0002] 雙特異性抗體（bispecific antibody，BiAb)是含有兩種特異性抗原結合位點的 人工抗體，能在靶細胞和功能分子（細胞）之間架起橋梁，產生導向性的效應功能。BiAb 在生物醫(yī)學中，特別是在腫瘤的免疫治療中具有廣闊的應用前景。通過BiAb介導細胞毒作 用殺死腫瘤細胞是當前免疫治療應用研宄的熱點，其主要特點是BiAb能同時結合腫瘤相 關抗原和免疫效應細胞上的靶分子，直接觸發(fā)免疫效應細胞對腫瘤細胞的特異性殺傷。然 而，在雙特異性抗體藥物研發(fā)過程中，特別是體內藥效研宄，很難建立一種由完整免疫系統(tǒng) 介導的人體腫瘤免疫殺傷的動物模型，因此建立完整的免疫殺傷模型對免疫治療性雙特異 性抗體藥物研發(fā)顯得尤為重要。以下是針對所研宄的免疫細胞抗原和腫瘤細胞抗原，以及 相關技術發(fā)展的一些【背景技術】介紹。
[0003] I. CD3
[0004] CD3分子由4種亞基組成：S、e、Y、G，其分子質量分別為18. 9k Da、23. lkDa、 20. 5k Da、18. 7k Da，其長度分別有171、207、182、164個氨基酸殘基。它們一起組成6條肽 鏈，常與T細胞受體（Tcell rec印tor，TCR)緊密結合形成含有8條肽鏈的TCR-CD3復合體， 結構示意圖見圖1。此復合體具有T細胞活化信號轉導，穩(wěn)定TCR結構的功能。CD3胞質段含 免疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)， 其作用是當TCR識別并結合由MHC(major histo-compatibility complex)分子提呈的抗 原肽后，導致CD3的ITAM的保守序列的酪氨酸殘基被T細胞內的酪氨酸蛋白激酶p561ck磷 酸化，然后可募集其他含有SH2(Scr homology 2)結構域的酪氨酸蛋白激酶（如ZAP-70)。 ITAM的磷酸化和與ZAP-70的結合是T細胞活化信號傳導過程早期階段的重要生化反應之 一。因此，CD3分子的功能是轉導TCR識別抗原所產生的活化信號。
[0005] 2. HER2
[0006] 1981 年 Shih 等（Shih C，Padhy LC，Murray M，et al. Transforming genes of carcinomas and neuroblastomas introduced into mouse fibroblasts[J]. Nature, 1981,290(5803) :261-264.)首次從大鼠神經母細胞瘤基因組中克隆出癌基因 neu，Slamon 等（1987，Science 2;35;177-182)從人 cDNA 文庫中分離出 HER2 基因。隨后 的序列分析和染色體譜分析發(fā)現(xiàn)neu和HER2為同一個基因，習慣上稱為HER2/neu基因或 c-erbB-2基因。HER2是人類表皮生長因子受體家族的第2個成員，該家族屬于I型受體酪 氨酸激酶，又稱ErbB受體家族，其在許多正常和異常表皮細胞的生長、分化和轉移過程中 起著重要的調控作用，許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和病情輕重與其活性大小密切相關。家族內共 有四個受體：HER1，HER2, HER3和HER4。這些受體可以相互作用產生異源或同源二聚體，激 活細胞內多條信號轉導通路，其中J1ER2在細胞信號轉導過程中起著重要作用。HER2的結構 包括胞外生長因子的結合區(qū)，親脂的跨膜區(qū)和帶有調節(jié)羧基末端片段的胞內區(qū)。J1ER2受體 胞內區(qū)有酪氨酸蛋白激酶PTK活性，自身也具有若干酪氨酸殘基Tyr磷酸化位點。特異性 生長因子與J1ER2受體結合后可誘導二聚體化并激發(fā)受體的交叉磷酸化，磷酸化的受體可 以把細胞外的生長信號迅速轉導至核內，刺激控制與細胞分裂有關的基因表達。
[0007] HER2定位于人染色體17q21，編碼分子量為185kD的跨膜蛋白，具有酪氨酸激酶 RTK活性，正常情況下處于非激活狀態(tài)，參與細胞正常分化的調節(jié)，通常只在胎兒期表達， 成年后，僅在極少數(shù)正常組織內微量表達。正常細胞中HER2基因為2個拷貝，基因突變 可將其激活，其擴增將導致轉錄上調，蛋白合成增加，從而抑制腫瘤細胞凋亡，促進腫瘤細 胞增殖，上調血管內皮生長因子VEGF/血管通透性因子VPF，促進腫瘤新生血管生成，增加 腫瘤細胞侵襲力，破壞機體組織抗侵襲屏障等[Artufel MV，Valero AC, Llado RR，etal. Molecular Protocol for Her-2/neu analysis in breast carcinoma[J]. Cl in Transl 0ncol，2005,7. (11) :504-511.hHER2蛋白的過度表達也在細胞的分裂、增殖、轉化、促進腫 瘤的轉移、侵襲、粘附中發(fā)揮重要作用[Hynes NE, Stem DF. The biology of erbB-2/neu/ HER-2and its role in cancer[J]. Biochem Biophys Acta, 1994, 1198(2-3):165-184. ]〇 [0008] 除可發(fā)生基因突變或擴增外，上調HER2的表達也可激HER2下游的兩個主要信號 轉導途徑：MAPK通路，PI3K/Akt通路，從而引發(fā)瀑布式連鎖反應，調節(jié)凋亡相關基因，促進 細胞無限增殖分化，抑制凋亡，從而發(fā)生癌變。前者主要參與細胞的有絲分裂，后者主要影 響細胞的存活和凋亡。J1ER2可通過MAPK途徑活化Ets轉錄因子家族成員ER81而上調人端 粒末端轉移酶逆轉錄酶hTERT，進而導致細胞端粒末端轉移酶異?；罨?，使細胞轉化并進 入永久增殖狀態(tài)[Gouel iBS, JanknechtR. Upregulation of the catalytic telomerase subunit by the transcription factor ER81and oncogenic HER2/Neu, Ras, or Raf. Mol Cell Biol, 2004, 24:25-35. ]。PI3K活化后，可催化磷脂酰肌醇PI生成PIP2和PIP3,它們 是細胞內重要的第二信使，能激活下游的蛋白激酶Akt/PKB，進一步導致下游BAD蛋白的磷 酸化，從而阻止BAD與凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL組成復合物，同時還誘導叉頭轉錄因子1 磷酸化，從而抑制原凋亡基因的表達。
[0009] 另外，HER2癌基因也是腫瘤轉移驅動因子，HER2過表達能通過啟動多種轉移相關 機制而增加腫瘤細胞轉移能力，如細胞迀移率、體外侵襲力、W型膠原酶活性等，還可以影響 某些黏附分子如上皮細胞媽黏蛋白等的合成，從而促進轉移。Carter等（CarterW, Hoying J, Boswell C, et al.HER-2/neu over-expression induces endothelial cell retraction[J]. Int Cancer, 2001, 91 (3) :295-299.)研宄認為，HER2 過表達可使內皮細胞 收縮，細胞間隙增寬，腫瘤細胞易于從內皮細胞間穿越，腫瘤細胞發(fā)生移位或轉移。多數(shù)研 宄認為，HER2基因擴增和（或）蛋白過表達往往提示腫瘤惡性程度高，轉移能力強。
[0010] J1ER2的過表達常與腫瘤的發(fā)生有關，例如：
[0011] (1)胃癌：胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，預后差，進展期胃癌5年生存率 僅為5%?20%，中位生存時間不超過1年。不同的研宄小組檢測HER2蛋白在胃癌中過 表達的比率變異為7%?43%。HER2蛋白在胃癌中的陽性表達與腫瘤分化程度、Lauren分 型及WHO分型有關，與年齡、性別、腫瘤發(fā)生部位及臨床分期不相關。
[0012] (2)乳腺癌：研宄表明，HER2在20%?30%的原發(fā)性乳腺浸潤性導管癌中有基因 的擴增和蛋白的過度表達。HER2的高表達常導致細胞的惡性轉移，因此HER2陽性的乳腺 癌浸潤性強，無病生存期短，預后差。體外實驗顯示，抑制J1ER2的表達可導致腫瘤細胞 的凋亡。
[0013] (3)卵巢癌：卵巢癌是婦科腫瘤致死的主要原因。卵巢癌中HER2的過表達與乳腺 癌中相似，占 15%?30%。Verri 等（Verri E，Guglielmini P，Puntoni M，et al.HER2/ neu oncoprotein overexpression in epithelial ovarian cancer:evaluation of its prevalence and prognostic significance[J]. Oncology, 2005, 68:154-161.)的石開宄 顯示，HER2陽性（2+/3+)患者比陰性患者（0/1+)總生存期顯著降低（29個月vs48個 月，P〈0. 05)。觀察III、IV期的卵巢癌20個卵巢細胞株發(fā)現(xiàn)，均存在HER2蛋白過表達。 [0014] (4)前列腺癌：前列腺癌發(fā)生時屬于雄激素依賴性，在接受藥物或手術去勢治療 后腫瘤退縮，但最終會轉變?yōu)樾奂に胤且蕾囆远^續(xù)生長，這是目前前列腺癌治療中最主 要的問題。研宄表明，J1ER2是前列腺癌從激素依賴型轉變?yōu)榧に胤且蕾囆瓦^程中的主要介 導者。Signoretti 等（Signoretti S, Montironi R, Manola J, et al. Her-2-neu expressio