灰毛豆內(nèi)生真菌tpl35及其在防治植物病害中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種米曲霉TPL35及其 防治植物病害中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 灰毛豆（repAmsia /7tf/77tfr<9a)是豆科（Leguminosae)灰毛豆屬（repAmsia )的多年生木本植物,主要分布于熱帶、亞熱帶地區(qū),如印度、巴基斯坦、越南、柬埔寨、 老撾、緬甸以及中國的廣東、廣西、云南、福建及湖南等地?；颐怪θ~可作綠肥，搗爛投水 中可毒魚，也是良好的固砂及堤岸保土植物?，F(xiàn)階段對灰毛豆的研究主要集中在植物化學(xué) 和藥理學(xué)方面，在內(nèi)生真菌方面還鮮有報道。
[0003] 植物病害一直是制約農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的重要因素之一，而在植物病害中，70%-80%的病害是由病原真菌侵染所引發(fā)的。植物真菌病害不僅直接造成農(nóng)作物產(chǎn)量下降與品 質(zhì)降低，而且部分病原真菌在侵染農(nóng)作物過程中，可分泌產(chǎn)生多種對人畜有害的毒素與 代謝物，對農(nóng)產(chǎn)品的安全性構(gòu)成極大威脅。
[0004] 化學(xué)防治是控制農(nóng)作物病害的有效方法，但化學(xué)農(nóng)藥污染環(huán)境，誘導(dǎo)病菌產(chǎn)生抗 藥性，破壞生態(tài)平衡，引起殘毒等問題也隨之而來，因此，植物病害的生物防治研究越來越 受到重視。而內(nèi)生真菌作為生物防治的手段之一，有著發(fā)酵成本低廉，技術(shù)手段簡單，不易 讓病原菌產(chǎn)生抗藥性等特點，潛力非常巨大。由于研究內(nèi)生真菌中抗菌活性物質(zhì)具有十分 重要的理論意義和應(yīng)用前景，另外內(nèi)生真菌普遍存在抗菌活性，所以近年來在這方面的進 展十分迅速。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：提供一株分離自灰毛豆葉片的內(nèi)生真菌米曲霉 價7ΛΛ5此尺從）TPL35,該菌株的發(fā)酵液以及發(fā)酵液提取物和菌絲提取物都對油菜 菌核菌等病原菌具有較高的生防活性，因此可以將TPL35作為生防菌應(yīng)用于相應(yīng)的病原真 菌引起的植物疾病中，亦可繼續(xù)利用該內(nèi)生真菌資源獲得天然活性物質(zhì)，為生物源農(nóng)藥的 開發(fā)提供依據(jù)。
[0006] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：一株灰毛豆（PtfrjDtfrea)內(nèi)生真菌米曲霉 orj^ae)TPL35,其于2014年11月27日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(地 址：中國，武漢，武漢大學(xué))，保藏編號CCTCC NO :M 2014608,經(jīng)檢測存活。
[0007] 本發(fā)明所述灰毛豆（/WrjDtfrea)內(nèi)生真菌系從中國湖南省湖南農(nóng)業(yè)大 學(xué)校園內(nèi)的灰毛豆植物活體中，經(jīng)分離、培養(yǎng)、發(fā)酵和活性測試等步驟獲得并保存的。
[0008] 米曲霉TPL35的固體培養(yǎng)特征為：在PDA培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng)，菌落初為白色， 后期變?yōu)榈S色或白色，密生小顆粒狀孢子團。顯微鏡形態(tài)特征：分生孢子無色，呈卵圓形。
[0009] 米曲霉TPL35的分子生物學(xué)特征：采用PCR技術(shù)，DNA序列測定分析，TPL35菌株 ITSrDNA基因組由597個堿基組成。于美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI)進行同源性比對 分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，顯示菌株與OiTzae⑶120193. 1聚在一枝上，序列相 似性為99%，可確定該菌株為米曲霉。
[0010] 本發(fā)明灰毛豆內(nèi)生真菌抗植物病原真菌發(fā)酵液的具體制備操作步驟如下： (1)菌種的活化。用接種針將已保存于斜面的內(nèi)生真菌TPL35轉(zhuǎn)接于已滅菌PDA平板 上，28°C恒溫培養(yǎng)4-5天，得到活化菌種。
[0011] (2)發(fā)酵培養(yǎng)。在已純化的內(nèi)生真菌TPL35 PDA平板邊緣，用無菌的打孔器打成直 徑6mm的菌餅，接種2塊菌餅于裝有IOOmLPDB的250mL錐形瓶中，在28°C ± I °C，200r .rniiT1 搖床上震蕩培養(yǎng)6-7天，即得到灰毛豆內(nèi)生真菌TPL35的發(fā)酵液。用濾紙過濾除去菌絲體， 菌液再過0. 22um針頭式過濾器，即得到灰毛豆內(nèi)生真菌TPL35抗病原真菌的發(fā)酵液。
[0012] 發(fā)酵所需培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB)，具體做法是：稱取新鮮馬鈴薯 200克，去皮切成小片，加超純水煮沸30分鐘，四層紗布過濾，濾液加入葡萄糖20克混勻， 加水定容至1升，PH自然。121°C，35分鐘滅菌備用。活化菌種所需固體培養(yǎng)基：上述培養(yǎng) 基中加入20克瓊脂，S卩PDA培養(yǎng)基。
[0013] 所述植物致病真菌包括：油菜菌核菌，水稻紋枯菌，草莓灰霉菌，黃瓜疫霉菌，煙草 黒脛菌，柑橘炭疽菌。上述植物病原真菌均采用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)。
[0014] 采用平板對峙方法進行初篩，將內(nèi)生真菌菌株TPL35和病原真菌分別用6mm的 打孔器制成菌餅，分別置于PDA平板的1/3處，28°C下培養(yǎng)，觀察內(nèi)生菌株和供試病原真 菌是否有拮抗作用。
[0015] 菌株TPL35發(fā)酵液對病原菌菌絲生長抑制測定。量取一定量的無菌發(fā)酵液（對 照用空白發(fā)酵液）與融化狀態(tài)下的PDA培養(yǎng)基（40-50°C，無菌發(fā)酵液與培養(yǎng)基的體積比為 1 : 9)混均，倒平板（每皿約IOmL)，待凝固后接植物病原真菌（菌餅直徑6_)，處理、對照 各重復(fù)3次。置于28土 1°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3-5天后，用十字交叉法測量病原菌真菌菌落直 徑，按照下式計算抑制率。
[0016] 菌絲生長抑制率（％ )=(對照菌落直徑一處理菌落直徑V (對照菌落直徑一 6) XlOO 測定結(jié)果表明：米曲霉TPL35的發(fā)酵液對油菜菌核菌和煙草黑脛菌有很好的抑菌活 性，抑菌率分別為84. 26%和60. 29%，都在50%以上。該代謝產(chǎn)物可應(yīng)用于植物真菌病害的 防治，為農(nóng)用殺菌劑的開發(fā)增添了新的途徑。
[0017] 菌株TPL35發(fā)酵液提取物和菌絲體提取物對病原真菌的活性測定。用8層紗布將 菌絲體和發(fā)酵液分離，發(fā)酵液分別用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取2-4次，濃縮 得到各萃取層浸膏，菌絲以100 mL甲醇提取2-4次，減壓濃縮為菌絲體提取物。再以濾紙 片法測定TPL35各提取物的活性。結(jié)果表明：菌株TPL35的活性代謝產(chǎn)物主要集中在發(fā)酵 液乙酸乙酯萃取層，尤其是對油菜菌核菌有明顯的抑制作用。
[0018] 同時，本發(fā)明還提供所述灰毛豆內(nèi)生真菌米曲霉TPL35在防治植物病原真菌所致 植物病害中的應(yīng)用，其利用所述真菌的發(fā)酵液、發(fā)酵液提取物或菌絲體提取物進行應(yīng)用。
[0019] 所述的植物病害是油菜菌核病、煙草黒脛病。
[0020] 本發(fā)明還提供一種農(nóng)用殺菌劑，其包含所述的發(fā)酵液，或其發(fā)酵液提取物，或其菌 絲體提取物。
[0021] 所述殺菌劑，所述發(fā)酵液提取物是分別用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取 2-4次，濃縮得到各萃取層浸膏即成；所述菌絲體提取物是以甲醇提取2-4次，減壓濃縮即 為菌絲體提取物。
[0022] 本發(fā)明的優(yōu)點：首次從灰毛豆中分離內(nèi)生真菌，并得到活性菌株米曲霉 價7ΛΛ5此尺從）TPL35,該菌株的發(fā)酵液以及發(fā)酵液提取物和菌絲提取物都對油菜 菌核菌和煙草黒脛菌等病原菌具有較高的生防活性，抑菌率分別為84. 26%和60. 29%，都在 50%以上。因此可以將TPL35作為生防菌應(yīng)用于相應(yīng)的病原真菌引起的植物疾病中，亦可繼 續(xù)利用該內(nèi)生真菌資源獲得天然活性