一種厭氧菌的分離培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，特別是涉及石油生產(chǎn)回用水、油田污水及含油污泥中厭氧菌的分離培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在石油化工行業(yè)中，微生物引起的腐蝕導(dǎo)致了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。有文獻(xiàn)報(bào)道，油井中75%以上的腐蝕、埋地管道和線纜中50%的故障來自微生物的腐蝕(主要是硫酸鹽還原過程)；另有2008年的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，在我國，每年由于腐蝕對油田造成的損失高達(dá)2億元。
[0003]隨著多數(shù)陸上油田的開采進(jìn)入中、后期，為提高采出率注水、注蒸汽及油田回注水的量均在逐年增加，采出原油的含水率也在增高，為了防止微生物腐蝕就需要在油田生產(chǎn)用水中投加更多的化學(xué)殺菌劑，由于微生物進(jìn)化速度快，對環(huán)境的適應(yīng)能力強(qiáng)，往往導(dǎo)致長期使用的殺菌劑效力下降，同時(shí)大量殺菌劑的投加又引起油田污水處理的難度增強(qiáng)。所以，微生物對油田造成的損失正在逐年上升。
[0004]石油生產(chǎn)過程中引起腐蝕的微生物可分為厭氧和好氧兩大類，在實(shí)際生產(chǎn)環(huán)境中，細(xì)菌群體中多種厭氧菌與好氧菌共存一起，好氧與厭氧腐蝕一般會(huì)同時(shí)發(fā)生，引起腐蝕的微生物主要有:硫酸鹽還原菌(發(fā)生硫酸鹽還原過程)、硫氧化菌、腐生菌、鐵細(xì)菌和真菌。有文獻(xiàn)報(bào)道，其中的硫酸鹽還原菌不僅會(huì)造成設(shè)備腐蝕，同時(shí)由于其代謝過程中產(chǎn)生硫化氫，有潛在的人身安全危害，而油田上由于硫化氫引起的安全事故也屢見報(bào)道。
[0005]要防止微生物引起的腐蝕，同時(shí)盡量減少化學(xué)殺菌劑對環(huán)境的污染，就要從研究微生物的生理特性著手，尋找抑制其生長繁殖的因素。所以，首先要從生產(chǎn)環(huán)境中分離出引起危害的微生物，其中好氧微生物的分離比較簡單。而傳統(tǒng)的厭氧菌分離培養(yǎng)方法，如厭氧罐、hungate滾管法和厭氧工作站中夾層培養(yǎng)等方法，操作復(fù)雜，過程耗時(shí)長，且費(fèi)用較高。
[0006]CN200710064715.3公開了一種厭氧菌的分離培養(yǎng)方法，該方法在整個(gè)操作過程中避免了目的微生物與氧氣的接觸，操作成本相對低廉，尤其適于生長溫度高于50°C且對厭氧環(huán)境要求嚴(yán)格的難分離高溫厭氧菌、嚴(yán)格厭氧菌的分離培養(yǎng)。該方法只需在厭氧菌分離的部分操作時(shí)使用厭氧工作站，培養(yǎng)時(shí)可以使用普通培養(yǎng)箱，無需繼續(xù)提供厭氧環(huán)境，避免了分離培養(yǎng)時(shí)一臺(tái)厭氧工作站只能用于一種生長溫度的細(xì)菌的情況。但是，該發(fā)明利用未凝固瓊脂(溫度高于50°C)的培養(yǎng)基與細(xì)菌富集液混合的方式接種，對于生長環(huán)境溫度低于50°C的厭氧菌，該發(fā)明所述的接種過程會(huì)影響待分離微生物的活性，甚至導(dǎo)致其死亡。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供一種厭氧菌的分離培養(yǎng)方法。本發(fā)明方法在固體培養(yǎng)基中會(huì)形成接種面平整光滑的厭氧培養(yǎng)腔，為厭氧菌的培養(yǎng)提供厭氧環(huán)境，減少了厭氧設(shè)備的使用，簡化了分離過程，節(jié)省了分離過程的費(fèi)用，縮短了獲得單菌株的時(shí)間。
[0008]本發(fā)明厭氧菌的分離培養(yǎng)方法,包括培養(yǎng)基的配制、培養(yǎng)基滅菌前充氮?dú)狻⒕N的富集培養(yǎng)和菌種的分離培養(yǎng)；其中菌種的分離培養(yǎng)采用液體培養(yǎng)基與固體培養(yǎng)基交替接種培養(yǎng)的方式，液體培養(yǎng)基向固體培養(yǎng)基接種采用毛細(xì)玻璃管蘸取待分離菌液穿刺接種，在固體培養(yǎng)基中形成一個(gè)接種面光滑的圓柱狀厭氧培養(yǎng)腔，接種后采用未凝固的培養(yǎng)基將固體培養(yǎng)基表面形成的圓孔密封，從而形成密封的厭氧培養(yǎng)腔，厭氧培養(yǎng)腔的內(nèi)壁為厭氧菌的培養(yǎng)面；固體培養(yǎng)基向液體培養(yǎng)基接種是將接種針伸入到厭氧培養(yǎng)腔內(nèi)，從培養(yǎng)面上挑取形成的單菌落接入液體培養(yǎng)基。
[0009]本發(fā)明中，所述的培養(yǎng)基的配制，根據(jù)待分離厭氧菌的原處環(huán)境，確定相應(yīng)的培養(yǎng)基的組成和配比。
[0010]本發(fā)明中，所述培養(yǎng)基滅菌前充氮?dú)?，目的是除去培養(yǎng)基中的氧氣，為厭氧菌的生長提供厭氧環(huán)境。
[0011]本發(fā)明中，所述菌種的富集培養(yǎng)是將菌種先進(jìn)行活化，然后在相應(yīng)的液體培養(yǎng)基經(jīng)過2飛次轉(zhuǎn)接獲得富集菌液。接種不用在厭氧工作站中進(jìn)行，只需要用滅菌后的針管刺入培養(yǎng)瓶上的膠塞接種吸取相應(yīng)量的菌液。初次活化接種時(shí)為保證成功率，接種量占培養(yǎng)基體積的10°/Γ20%。獲得菌液之后，液體培養(yǎng)基之間的接種量占培養(yǎng)基體積的59TlO%。接種過程要迅速以減少菌液在空氣中的暴露時(shí)間，接種完畢后立即蠟封即可。
[0012]本發(fā)明中，所述菌種的分離培養(yǎng)是將富集菌液梯度稀釋后向固體培養(yǎng)基接種的過程，需要在厭氧工作站中進(jìn)行，接種完畢后加膠塞，并在移出厭氧工作站之后立即蠟封。培養(yǎng)瓶的蠟封用于對接種完畢后培養(yǎng)瓶膠塞與瓶口之間進(jìn)行密封，避免空氣的進(jìn)入，維持長時(shí)間培養(yǎng)過程中培養(yǎng)瓶內(nèi)的厭氧環(huán)境。
[0013]本發(fā)明中，富集菌液向固體培養(yǎng)基穿刺接種時(shí)，接種量為用毛細(xì)玻璃管在稀釋好的菌液中蘸取一次即可。所述的毛細(xì)玻璃管規(guī)格為外徑2.(Γ4.0mm,內(nèi)徑1.5^3.0mm,長度l(T20cm，可以向生產(chǎn)廠家定制或購買標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格。由于毛細(xì)玻璃管壁薄中空，在穿刺接種過程中能帶出進(jìn)入毛細(xì)玻璃管中的培養(yǎng)基，而不會(huì)破壞固體培養(yǎng)基的整體性，并且能在固體培養(yǎng)基中形成接種面平整光滑的厭氧培養(yǎng)腔，這樣有利于挑菌時(shí)對單菌落的辨識(shí)。所述的毛細(xì)玻璃管穿刺接種時(shí)最好觸及培養(yǎng)瓶的底部或內(nèi)壁，這樣做能更好地借助毛細(xì)玻璃管帶出其中的培養(yǎng)基，有利于形成一個(gè)完整的、接種面光滑的圓柱狀厭氧培養(yǎng)腔。毛細(xì)玻璃管穿刺接種時(shí)最好與培養(yǎng)基表面傾斜，這樣有利于菌落的挑取。
[0014]本發(fā)明中，穿刺接種后在固體培養(yǎng)基表面會(huì)形成一個(gè)圓孔，圓孔直徑與毛細(xì)玻璃管的內(nèi)徑有關(guān)。圓孔的密封可以采用滴管或移液槍在培養(yǎng)基表面圓孔上滴數(shù)滴未凝固培養(yǎng)基形成密封層，由于未凝固培養(yǎng)基遇到固體培養(yǎng)基后很快冷卻凝固，不會(huì)接觸到厭氧腔體內(nèi)的接種面，從而不會(huì)破壞厭氧培養(yǎng)腔。對于生長溫度較低的厭氧菌，本發(fā)明的接種過程不會(huì)因?yàn)闇囟冗^高影響待分離厭氧菌的活性或?qū)е缕渌劳?。本發(fā)明方法適用于原生長環(huán)境在10-60°C的菌種，分離過程與培養(yǎng)過程均可以很好的保持原生長溫度。
[0015]本發(fā)明中，挑取單菌落時(shí)，所述培養(yǎng)基表面圓孔的密封層，可以先用滅菌后的鑷子去除，然后利用接種針挑取單菌落。
[0016]本發(fā)明中，培養(yǎng)溫度可根據(jù)待分離菌種原生長環(huán)境確定，可以在1(T60°C培養(yǎng)3?7天。
[0017]本發(fā)明中，培養(yǎng)瓶采用厭氧菌培養(yǎng)瓶，優(yōu)選利用醫(yī)用廢棄的玻璃輸液瓶，為節(jié)約培養(yǎng)基的用量富集培養(yǎng)過程可以利用50mL的輸液瓶，分離培養(yǎng)可以利用10mL的輸液瓶，用過的輸液瓶清洗、滅菌后可以多次重復(fù)使用。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下突出效果:
1、利用毛細(xì)玻璃管實(shí)現(xiàn)從液體培養(yǎng)基向固體培養(yǎng)基穿刺接種，在固體培養(yǎng)基中形成一個(gè)接種面光滑的圓柱狀厭氧培養(yǎng)腔，接種后采用未凝固的培養(yǎng)基將固體培養(yǎng)基表面形成的圓孔密封，從而形成密封的厭氧培養(yǎng)腔，本發(fā)明方法提供了厭氧菌生長的厭氧環(huán)境，不會(huì)影響菌體的生物活性，并且易于單菌落的辨識(shí)與挑取，縮短了獲得單菌株的時(shí)間。
[0019]2、本發(fā)明只有從液體培養(yǎng)基向固體培養(yǎng)基利用毛細(xì)玻璃管接種的過程和從固體培養(yǎng)基向液體培養(yǎng)基挑取單菌落的過程需要在厭氧工作站中進(jìn)行，減少了對厭氧工作站的使用。接種后菌種的培養(yǎng)只需在普通培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，不需要專門的厭氧培養(yǎng)設(shè)備，培養(yǎng)溫度的調(diào)節(jié)更方便，避免了分離培養(yǎng)時(shí)一臺(tái)厭氧設(shè)備只能用于一種生長溫度的菌體的情況，節(jié)省了厭氧菌分離過程的費(fèi)用。
[0020]3、與平皿夾層培養(yǎng)相比，本發(fā)明避免了未凝固固體培養(yǎng)基的高溫對厭氧菌的活性的影響，有利于保持菌種分離、培養(yǎng)環(huán)境溫度的一致性。與培養(yǎng)基表面蠟封方式相比，節(jié)省了耗材，并且在菌種轉(zhuǎn)接過程中操作更方便，加速了厭氧菌的分離過程。本發(fā)明在人工操作上難度降低，減少了厭氧菌培養(yǎng)分離過程中對厭氧工作站的依賴，從而節(jié)約了耗材(如氮?dú)?。
【具體實(shí)施方式】
[0021 ] 下面通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0022]首先對待分離厭氧菌來源處的水樣水質(zhì)進(jìn)行分析，獲取相應(yīng)的原處環(huán)境的信息，進(jìn)而調(diào)整已有的培養(yǎng)基配方，以保持分離所得菌種在生理特性研究過程中所處環(huán)境與原處環(huán)境盡可能一致。這樣做一方面可以減少獲得單菌株的時(shí)間，另一方面使獲得數(shù)據(jù)與實(shí)際更為相符。
[0023]培養(yǎng)基配制完畢分裝好后，首先充氮?dú)猓缓髮ε囵B(yǎng)基及實(shí)驗(yàn)用具進(jìn)行高溫滅菌。培養(yǎng)瓶上的膠塞要在滅菌前蓋好，膠塞與瓶口之間夾線繩，以防止高溫滅菌過程中膠塞因氣體膨脹被彈出，滅菌完畢后，首先要抽掉線繩并蓋好膠塞。
[0024]對油田回注水中厭氧菌的初次富集，接種量要大，占液體培養(yǎng)基體積的10°/Γ20%。厭氧菌的富集菌液通過在液體培養(yǎng)基間轉(zhuǎn)接2飛次獲得，富集轉(zhuǎn)接過程利用普通針筒將富集菌液轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基，整個(gè)過程在普通操作臺(tái)上進(jìn)行，接種完畢后進(jìn)行蠟封處理