一種能抑制霉菌并降解霉菌毒素的生態(tài)修復(fù)菌劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)，特別是一種能抑制霉菌并降解霉菌毒素的生態(tài)修 復(fù)菌劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 飼料的霉菌污染是直接影響?zhàn)B殖業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量重要因素。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO) 估算，目前世界上至少有25%的谷物被霉菌和霉菌毒素污染，每年所造成的經(jīng)濟損失高達 數(shù)億美元。我國霉菌和霉菌毒素污染狀況更不容樂觀，僅北京地區(qū)，谷物霉菌毒素污染率竟 達90%，其中嚴重污染而應(yīng)當(dāng)禁用的達15-25%。在氣候溫暖的南方地區(qū)霉菌污染情況更為 嚴重。霉菌一般都會產(chǎn)生霉菌毒素，如常見的黃曲霉會產(chǎn)生黃曲霉毒素，黃曲霉毒素是毒性 最強、危害最大的。黃曲霉毒素能引起肝壞死、降低生產(chǎn)效率，導(dǎo)致先天性缺陷、促進腫瘤產(chǎn) 生以及抑制免疫系統(tǒng)等。危害較大的霉菌毒素還有：玉米赤霉烯酮（F2毒素)、嘔吐毒素和 單端孢霉烯酮（T2毒素)，這些毒素均由鐮刀菌產(chǎn)生，也都具有強烈的毒性，對動物、植物和 人體危害極大。導(dǎo)致人參種植重茬病產(chǎn)生的主要原因是人參土壤內(nèi)受到鐮刀菌【霉菌的一 種，能產(chǎn)生玉米赤霉烯酮（F2毒素)、嘔吐毒素和單端孢霉烯酮（T2毒素）等】及其所產(chǎn)毒素 的污染。
[0003] 谷物飼料的防霉，除嚴格控制水分，盡量縮短儲藏等措施外，添加防霉劑，防止谷 物飼料霉菌污染是更重要的措施。傳統(tǒng)的物理和化學(xué)方法去除霉菌毒素存在效果不穩(wěn)定、 營養(yǎng)成分損失大、飼料適口性差，難以規(guī)模化生產(chǎn)等缺點，較難廣泛用于生產(chǎn)實踐。微生物 及生物酶解毒因具有效率高、特異性強、對飼料和環(huán)境無污染等特點和優(yōu)勢，備受研究者的 關(guān)注。霉菌毒素生物降解指微生物、植物及其代謝產(chǎn)生的酶與毒素作用，使其分子結(jié)構(gòu)中毒 性基團被破壞而生成無毒降解產(chǎn)物的過程.目前，市場上存在的防霉劑主要有丙酸鹽類、 苯甲酸及其鹽、山梨酸及其鹽等。這些防霉劑，具有較廣的抗菌譜，對霉菌和其它真菌、酵母 菌等都有一定的抑制作用。但是，這些防霉劑僅能抑制霉菌，并不能分解或促進霉菌毒素分 解。土壤消毒劑也僅是殺滅一些霉菌，也不能降解霉菌所產(chǎn)的毒素。因此，篩選多種有效菌， 不僅抑制霉菌并且能夠降解霉菌所產(chǎn)毒素，是勢在必行，是更科學(xué)、更有意義的技術(shù)方法。 制成微生物飼料添加劑（吸附于滅菌麥麩)，用于修復(fù)動物腸道生態(tài)系統(tǒng)。若制成土壤生態(tài) 修復(fù)劑(吸附于秸桿生物炭)，可以修復(fù)因霉菌和霉菌毒素污染造成的重茬病生態(tài)系統(tǒng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的在于針對上述存在問題，提供一種高密度、高活性的能抑制霉菌并降 解霉菌毒素的生態(tài)修復(fù)菌劑。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案： 一種能抑制霉菌并降解霉菌毒素的生態(tài)修復(fù)菌劑，由枯草芽孢桿菌（ 5?辦ii/is ACCC10619)、沼澤紅假單胞菌（押/狀iris ACCC10649 )、 奠腸球菌/aeca/is ACCC10180)、黃桿菌（新分 離，ACCC19729)和產(chǎn)朊假絲酵母WiB1S ACCC20060)混合組成，其中枯草芽孢 桿菌、沼澤紅假單胞菌、糞腸球菌和產(chǎn)朊假絲酵母購于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心 (ACCC)，也是農(nóng)業(yè)部允許在微生物飼料添加劑中使用的菌種，黃桿菌是從吉林省通化市人 參種植土中新分離的菌種，經(jīng)ACCC基因鑒定為黃桿菌（FawiersieB/a/seflii)，已經(jīng)送中 國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ACCC)保藏。
[0006] -種所述能抑制霉菌并降解霉菌毒素的生態(tài)修復(fù)菌劑的制備方法，將菌種分別接 種于相應(yīng)的無菌培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，經(jīng)過三級擴大培養(yǎng)，最后吸附、固化于秸桿生物炭上制 得固體菌劑，具體步驟如下： 1) 將冰箱冷藏保存的各斜面菌種活化后，分別經(jīng)搖瓶擴大培養(yǎng)制成一級種子液； 2) 將上述各菌種一級種子液分別在滅菌培養(yǎng)基內(nèi)進行二級擴大培養(yǎng)制成二級擴大培 養(yǎng)液，枯草芽胞桿菌、沼澤紅假單胞菌、糞腸球菌和黃桿菌培養(yǎng)條件是：接種量為5-lOwt%、 溫度37土 1°C、pH值L 0±(λ 2、攪拌速度100-150r/min、壓力(λ 05MPa，產(chǎn)朊假絲酵母的培 養(yǎng)條件是：溫度30 ± I °C，其它培養(yǎng)條件與上述四個種菌種相同。
[0007] 3)將上述各菌種二級培養(yǎng)液分別在滅菌培養(yǎng)基內(nèi)進行三級擴大培養(yǎng)制成三 級擴大培養(yǎng)液，枯草芽胞桿菌、沼澤紅假單胞菌、糞腸球菌和黃桿菌培養(yǎng)條件是：接種量 5-10￥七％、溫度37±11：、口!1值7.0±0.2、攪拌速度 200-25017^11、壓力0.05 1〇^;產(chǎn)朊假絲 酵母擴大培養(yǎng)條件是：溫度30±1°C .其它培養(yǎng)條件與上述四種細菌相同。
[0008] 4)將上述五個菌種的三級擴大培養(yǎng)液，按質(zhì)量比1: 1: 1: 1:1的比例混合均勻，得 到菌劑混合液； 5) 將上述菌劑混合液噴灑于秸桿生物炭上，邊噴灑邊攪拌，使菌液均勻地吸附、固化于 秸桿生物炭上制得固體菌劑； 6) 將制成的固體菌劑密封于內(nèi)襯聚乙烯的包裝袋內(nèi)，室溫保存，防潮、防暴曬。
[0009] 所述菌種活化方法是：把瓊脂斜面保存的各菌菌種從冰箱冷藏室取出，放于超凈 工作臺內(nèi)，在酒精燈火焰旁，分別轉(zhuǎn)接于瓊脂平板培養(yǎng)基上，在30-37°C下培養(yǎng)20-30h后， 平板上生長出大大小小的菌落，再從平板上菌落中挑取單菌落轉(zhuǎn)接于滅菌試管中的培養(yǎng)液 中。
[0010] 所述活化后的每個菌種擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基分別是：枯草芽胞桿菌的培養(yǎng)基為牛肉 膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA)，再添加質(zhì)量分數(shù)為0. 5%的蔗糖，pH值7. 0±0. 2 ;沼澤紅假單胞菌 的培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA)，再添加質(zhì)量分數(shù)為0. 1%的乙酸鈉，pH值7. 0±0. 2 ; 糞腸球菌的培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA)，再添加質(zhì)量分數(shù)為0.2%酵母膏，pH值 7. 0±0. 2 ;黃桿菌的培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA)，pH值7. 0±0. 2 ;產(chǎn)朊假絲酵母的 培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，自然pH值；各菌培養(yǎng)基的滅菌條件：壓力為0. IMPa、溫度為121°C、時 間 30min。
[0011] 所述秸桿生物炭是將玉米秸桿粉粹后，在厭氧或少氧條件下，400-45(TC加熱 12-14h制備成的無菌炭化物，菌種混合液與秸桿生物炭的質(zhì)量比為1:4-5。
[0012] 本發(fā)明的優(yōu)點是：該生態(tài)修復(fù)菌劑具有高密度、高活性的優(yōu)良特性。其中枯草芽孢 桿菌、沼澤紅假單胞菌、糞腸球菌以及新分離出的黃桿菌均有抑制霉菌并能降解霉菌毒素 的作用，尤其是與產(chǎn)阮假絲酵母配合，其降解霉菌毒素的作用明顯增加；該生態(tài)修復(fù)菌劑可 以作為飼料添加劑解決飼料行業(yè)霉菌及霉菌毒素污染問題，也可以作為土壤生態(tài)修復(fù)劑解 決人參、三七種植中重茬病漫延的問題。
【具體實施方式】
[0013] 實施例： 一種能抑制霉菌并降解霉菌毒素的生態(tài)修復(fù)菌劑，由枯草芽孢桿菌（ 5?辦ii/is ACCC10619)、沼澤紅假單胞菌pa/iAstris ACCC10649 )、奠 腸球菌（ihierococcWs /aeca/is ACCC10180)、黃桿菌（ACCC19729」 和產(chǎn)朊假絲酵母WiB1S ACCC20060)混合組成，其中枯草芽孢桿菌、沼澤紅假單 胞菌、糞腸球菌和產(chǎn)朊假絲酵母購于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ACCC)，也是農(nóng)業(yè) 部允許在微生物飼料添加劑中使用的菌種，黃桿菌是從吉林省通化市人參種植土中新分離 的菌種，經(jīng)ACCC基因鑒定為黃桿菌（r故ztersieB/a/smii)，已經(jīng)送中國農(nóng)業(yè)微生物菌種 保藏管理中心（ACCC)保藏。
[0014] 所述能抑制霉菌并降解霉菌毒素的生態(tài)修復(fù)菌劑的制備方法，將菌種分別接種于 相應(yīng)的滅菌培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，經(jīng)過三級擴大培養(yǎng)，最后吸附、固化于秸桿生物炭上制得固 體菌劑，具體步驟如下： 1) 將冰箱冷藏保存的各斜面菌種活化后，分別經(jīng)搖瓶擴大培養(yǎng)制成一級種子液； 2) 將上述各菌種一級種子液分別在無菌培養(yǎng)基內(nèi)進行二級擴大培養(yǎng)制成二級擴大培 養(yǎng)液，枯草芽胞桿菌、沼澤紅假單胞菌、糞腸球菌和黃桿菌培養(yǎng)條件是：接種量為l〇w%、溫 度37土 1°C、pH值7.0±0.2、攪拌速度100-150r/min、壓力0.05MPa，產(chǎn)朊假絲酵母的培養(yǎng) 條件是：溫度30 ± I °C，其它培養(yǎng)條件與上述四個種