一株以三聚氰胺為底物的降解菌及其篩選和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物降解有機(jī)污染物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一株以三聚氰胺為底物的 降解菌及其篩選和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 三聚氰胺（Melamine)，又稱密胺、氰尿酰胺、三聚酰胺，分子式為C3N 6H6，是一種三 嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，被廣泛應(yīng)用于化學(xué)工業(yè)的有機(jī)合成單體。工業(yè)中大量使用的三 聚氰胺最終會引起土壤和水體環(huán)境污染，進(jìn)而間接污染動植物產(chǎn)品。另外，已有研究報(bào)道， 由于三聚氰胺含氮量高達(dá)66. 67%，工業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)生的大量三聚氰胺廢渣可制成肥料施入 土壤。環(huán)境中殘留的這些三聚氰胺會造成植物中三聚氰胺的累積，進(jìn)而影響植物性農(nóng)產(chǎn)品 的食用安全性，因此，近年來，土壤中三聚氰胺的降解引起了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。
[0003] 利用微生物來降解各類人工合成的有機(jī)污染物，使其完全降解為無機(jī)物是目前最 具潛力的有效方法之一。三聚氰胺的微生物降解研究起步晚、成果少，現(xiàn)今國內(nèi)外僅有幾篇 報(bào)道。因此，分離、篩選具有高效降解三聚氰胺的微生物，對凈化環(huán)境、保障食品安全具有重 要的現(xiàn)實(shí)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一株以三聚氰胺為底物的降解菌及 其篩選和應(yīng)用，具體為一株以三聚氰胺為底物的降解菌及其篩選方法、用途、使用方法及含 有該菌的組合物。
[0005] 本發(fā)明所涉菌株洋蔥伯克霍爾德氏菌Burkholderia cepacia已于2014年10月 27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，保藏編號為CGMCC No. 9843,保藏單位地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 第一方面，本發(fā)明提供一種以三聚氰胺為底物的降解菌，所述降解菌為洋蔥伯克 霍爾德菌（Burkholderia cepacia)CGMCC No. 9843。
[0008] 第二方面，本發(fā)明提供一種以三聚氰胺為底物的降解菌的篩選方法，所述篩選方 法包括如下步驟：
[0009] 步驟一、降解菌的富集培養(yǎng)：稱取受三聚氰胺污染的土樣于含三聚氰胺的富集培 養(yǎng)基中，20-37°C、140-210r/min條件下培養(yǎng)7-10天，，轉(zhuǎn)接至新鮮的含三聚氰胺的富集培 養(yǎng)基培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接數(shù)次，得富集菌液；
[0010] 步驟二、降解菌的馴化培養(yǎng)：取富集菌液，轉(zhuǎn)接至基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，添加三聚氰胺進(jìn) 行馴化培養(yǎng)，20-37°C、140-210r/min條件下培養(yǎng)7-10天，轉(zhuǎn)接數(shù)次，得馴化菌液；
[0011] 步驟三、分離單菌落：稀釋馴化菌液，接種至LB固體培養(yǎng)基平板，于20-37°C恒溫 倒置培養(yǎng)3-5天，獲得降解菌的單菌落；
[0012] 步驟四、降解菌篩選：取降解菌的單菌落，轉(zhuǎn)接入含有三聚氰胺的篩選培養(yǎng)基中， 20-37°C恒溫倒置培養(yǎng)7-10天，挑選能夠生長并且有明顯透明圈的菌株，即得以三聚氰胺 為底物的降解菌。
[0013] 優(yōu)選地，步驟一中，所述富集培養(yǎng)基包括組分及含量：
[0014] MgSO4 · 7H30 0. 1-0. 3 g/L, K2HO4 0. 1-0. 3 g/L， (NH4)2SO4 0.1-0. 3 g/L， CaSO4 0. 05-0. 15 g/L, FeSO4 · 7H20 0. 001-0. 003 g/L， 葡萄糖 5. 0-15. 0 g/L， 蛋白胨 2.0-10.0 g/L pH 為 6. 0-8. 0。
[0015] 更優(yōu)選地，所述富集培養(yǎng)基包括組分及含量：
[0016] MgSOWH2O 0· 2 g/L， K2HPO4 0. I g/L, (NH4)2SO4 0. I g/L, CaSO4 0.05 g/L， FeSO4 · 7H20 0. 002 g/L， 葡萄糖 10. 0 g/L， 蛋白胨 5.0 g/L， pH 為 7.0。
[0017] 優(yōu)選地，步驟一中，所述富集培養(yǎng)基中，三聚氰胺的濃度隨轉(zhuǎn)接次數(shù)的增加而增 加。
[0018] 更優(yōu)選地，首次用于富集培養(yǎng)的富集培養(yǎng)基中的三聚氰胺的濃度為l〇mg/L，在隨 后的轉(zhuǎn)接中，每轉(zhuǎn)接一次，富集培養(yǎng)基中的三聚氰胺濃度增加 l〇mg/L。
[0019] 優(yōu)選地，步驟一中，所述轉(zhuǎn)接的接種量為l〇wt%，轉(zhuǎn)接次數(shù)為4次。
[0020] 優(yōu)選地，步驟二中，所述三聚氰胺濃度為40mg/L。
[0021] 優(yōu)選地，步驟二中，所述轉(zhuǎn)接的接種量為10wt%，所述轉(zhuǎn)接的次數(shù)為3次。
[0022] 優(yōu)選地，步驟二中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組分及含量包括：
[0023] MgSO4 · 7H20 0 . 2-0. 5g/L, K2HPO4 0· 1-0. 3 g/L， (NH4)2SO4 0.1-0, 3 g/L， CaSO4 0. 1-0. 3 g/L, FeSO4 ·7Η20 0 . 001-0 . 003 g/L pH 為 6. 0-8. 0;
[0024] 更優(yōu)選地，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組分及含量包括：
[0025] MgSO4 · 7H20 0.4 g/L, K2HPO4 0. 2 g/L, (NH4)2SO4 0. 2 g/L, CaSO4 0. I g/L, FeSO4 ·7Η20 0.002 g/L， pH 為 7. 0。
[0026] 優(yōu)選地，步驟三中，所述稀釋具體指將馴化菌液稀釋100-10000倍。
[0027] 優(yōu)選地，步驟三中，所述接種的方式包括劃線、涂布。
[0028] 優(yōu)選地，步驟三中，所述LB固體培養(yǎng)體的組分及含量包括：胰蛋白胨10g/L，酵母 提取物 l〇g/L，NaCl 5g/L，pH 為 6. 0-8. 0。
[0029] 更優(yōu)選地，所述LB固體培養(yǎng)基的組分及含量包括：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物 10g/L，NaCl 5g/L，pH 為 7. 0。
[0030] 優(yōu)選地，步驟四中，所述轉(zhuǎn)接包括用點(diǎn)涂的方式接種。
[0031] 優(yōu)選地，步驟四中，所述篩選培養(yǎng)基的組分及含量包括：
[0032] MgSO4 · 7H20 0. 1-0. 3 g/L, K2HPO4 0,5-1.0 g/L, (NH4)2SO4 0.5-1.0 g/L,
[0033] KH2PO4 0.2-1.0 g/L, NaCl 1.0-0.5 g/L, 瓊脂 I. 8-2. 0%， pH 6. 0-8. 0；
[0034] 更優(yōu)選地，所述篩選培養(yǎng)基的組分及含量包括：
[0035] MgSO4 · 7H30 0. I g/L， K2HPO4 0. 75 g/L， (NH4)2SOj 0.8g/L， KH2PO4 0. 5 g/L， NaCl I. 0 g/L， 瓊脂 2.0%，
[0036] pH為7. 0 ;所述百分比為質(zhì)量比。
[0037] 優(yōu)選地,步驟四中，所述三聚氰胺的濃度為10?60mg/L ;小于10mg/L篩選效果不 理想，大于60mg/L抑制細(xì)菌生長。
[0038] 本發(fā)明篩選得到的降解菌株是以三聚氰胺為唯一碳源的降解菌株。
[0039] 第三方面，本發(fā)明提供一種以三聚氰胺為底物的降解菌在修復(fù)三聚氰胺污染土壤 中的用途。
[0040] 第四方面，本發(fā)明提供一種以三聚氰胺為底物的降解菌在修復(fù)三聚氰胺污染土壤 中的方法。
[0041] 優(yōu)選地，所述方法包括向三聚氰胺污染土壤中加入以三聚氰胺為底物的降解菌的 菌液、吸附有以三聚氰胺為底物的降解菌的生物炭或吸附有以三聚氰胺為底物的降解菌的 含聚乙烯醇和海藻酸鈉載體。
[0042] 更優(yōu)選地，所述方法為向三聚氰胺污染土壤中加入吸附有降解菌的生物炭。
[0043] 第五方面，本發(fā)明提供一種含有以三聚氰胺為底物的降解菌和生物炭的組合物。
[0044] 本發(fā)明具有以下有益效果：
[0045] (1)本發(fā)明所采用的篩選方法中通過設(shè)計(jì)菌株篩選的各種培養(yǎng)基的配方，從普通 水稻田土壤中獲得高效降解三聚氰胺的菌株。所篩選的菌株對三聚氰胺降解效果明顯，消 解率達(dá)到82%以上。所述的篩選方法簡單易行、廉價經(jīng)濟(jì)。所得的菌株可以用來制備三聚 氰胺的降解菌劑，在實(shí)踐中有良好的應(yīng)用潛力。
[0046] (2)本發(fā)明利用普通水稻田土壤為處理對象，所得的降解菌是田間土壤中的土著 囷，制成囷劑后在田間應(yīng)用不易被排斥，效果良好。
【附圖說明】
[0047] 通過閱讀參照以下附圖對非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、 目的和優(yōu)點(diǎn)將會變得更明顯：
[0048] 圖1為透射電子顯微鏡下菌株MB4的形態(tài)圖；
[0049] 圖2為本發(fā)明提供的以三聚氰胺為底物的降解菌的生長曲線和對三聚氰胺的降 解效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0050] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù) 人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù) 人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明 的保護(hù)范圍。
[0051] 實(shí)施例1
[0052] 本實(shí)施例涉及一種三聚氰胺降解菌MB4,即洋蔥伯克霍爾德菌Burkholderia c印acia，（CGMCC No. 9843)的篩選。
[0053] 菌液的制備：稱取長期受三聚氰胺污染的土樣于含三聚氰胺的富集培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)條件37°C，180r/min，搖床培養(yǎng)7天，三聚氰胺的梯度接種量為10、20、30、40mg/L，以 10mg/L的梯度遞增，轉(zhuǎn)接4次；
[0054] 所述富集培養(yǎng)基的組分包括=MgSO4 · 7Η20(0· 2g