一種提高鴨黃病毒病毒滴度的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物病毒技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高鴨黃病毒病毒滴度的培養(yǎng)方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 鴨黃病毒（鴨坦布蘇病毒）是一種可以導(dǎo)致蛋鴨產(chǎn)蛋機(jī)能嚴(yán)重下降的病毒，其臨 床表現(xiàn)為產(chǎn)蛋率突然下降，產(chǎn)蛋高峰期縮短，嚴(yán)重的在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)蛋率可降為零，采食量也 會(huì)同時(shí)下降，個(gè)別有死亡現(xiàn)象。病理剖解可見(jiàn)卵巢充血、腫脹、壞死和萎縮等嚴(yán)重病變。該 病自從2010年首次在國(guó)內(nèi)被發(fā)現(xiàn)后，已經(jīng)造成山東、湖南、廣東等蛋鴨養(yǎng)殖大省蛋鴨大面 積減產(chǎn)。目前，許多研宄機(jī)構(gòu)在臨床分離到了鴨黃病毒，并在體外進(jìn)行了細(xì)胞感染試驗(yàn)，試 圖通過(guò)體外培養(yǎng)來(lái)使該病毒增殖以期用于鴨黃病毒疫苗的研制。多篇文獻(xiàn)報(bào)道指出，臨床 分離到的鴨黃病毒可對(duì)多種細(xì)胞進(jìn)行體外感染，如VERO細(xì)胞、BHK細(xì)胞等，但原代病毒培養(yǎng) 過(guò)程較為緩慢，病毒滴度不夠高，對(duì)于疫苗的研發(fā)是一個(gè)需要解決的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種提高鴨黃病毒病毒滴度的 培養(yǎng)方法，本發(fā)明所述的培養(yǎng)方法主要通過(guò)改變鴨黃病毒與細(xì)胞間的微環(huán)境，增加病毒與 細(xì)胞接觸親和度，從而大大提高鴨黃病毒病毒滴度。
[0004] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
[0005] 一種提高鴨黃病毒病毒滴度的培養(yǎng)方法，其包括以下步驟：
[0006] A、DMEM培養(yǎng)液的配制：將13. 4g DMEM干粉溶于IOOOml去離子水中，攪拌至完全 溶解后，調(diào)節(jié)PH值至6. 8?7. 8,并用彡0. 22um的無(wú)菌濾膜進(jìn)行除菌過(guò)濾，置于彡4°C的冰 箱待用；
[0007] B、往上述的DMEM溶液中加入占 DMEM培養(yǎng)液體積1 %?8 %的胎牛血清后，接種細(xì) 胞進(jìn)行單層培養(yǎng)；
[0008] C、待單層細(xì)胞培養(yǎng)好后，棄去培養(yǎng)容器內(nèi)的DMEM培養(yǎng)液，并用無(wú)菌洗液洗2?3 次；
[0009] D、棄去無(wú)菌洗液，然后往培養(yǎng)容器內(nèi)加入親和劑和步驟A所述的DMEM培養(yǎng)液，其 中親和劑的體積用量為DMEM培養(yǎng)液體積用量的0. 01%?1% ;
[0010] E、將培養(yǎng)容器置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)Imin?30min后，接種鴨黃病毒，混合 均勻后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2?5天，收獲病毒液。
[0011] 具體地，步驟B中所述的細(xì)胞為Vero細(xì)胞、293細(xì)胞、ST細(xì)胞、BHK細(xì)胞中的一種。
[0012] 具體地，步驟C中所述的無(wú)菌洗液為去離子水、PBS緩沖液、無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液中 的一種。
[0013] 具體地，步驟D中所述的親和劑由以下按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)的各組分制備而成：
[0014] 丙二酸0?1%; 磷酸 0?1%;
[0015] 山梨酸0?0·5%; 蘋(píng)果酸 0·01?1%;
[0016] 無(wú)機(jī)鹽0?3. 5%;去離子水余量。
[0017] 優(yōu)選地，步驟D中所述的親和劑由以下按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)的各組分制備而成：
[0018] 丙二酸 0· 03 ?0· 08% ;磷酸 0.06 ?0.08%;
[0019] 山梨酸0.1?0.3%; 蘋(píng)果酸 0.03?0.08%;
[0020] 無(wú)機(jī)鹽0.05?3%; 去離子水余量。
[0021] 優(yōu)選地，步驟D中所述的親和劑由以下按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)的各組分制備而成：
[0022] 丙二酸 0.05%;磷酸 0.08%;
[0023] 山梨酸0.3%; 蘋(píng)果酸 0.05%;
[0024] 無(wú)機(jī)鹽0.2%; 去離子水99.32%。
[0025] 具體地，所述無(wú)機(jī)鹽為硫酸鈉、磷酸氫二鈉、氯化鉀、氯化鈉中的一種或兩種以上。
[0026] 具體地，所述的硫酸鈉占親和劑總量的0. 15?0. 3% ;所述的磷酸二氫鈉占親和 劑總量的0. 1-1. 6%;所述的氯化鈉占親和劑總量的0. 09-0. 9%;所述的氯化鉀占親和劑總 量的 0. 01-1%。
[0027] 具體地，所述的親和劑是按以下步驟制備而成的：按配方量稱取丙二酸、磷酸、山 梨酸、蘋(píng)果酸、無(wú)機(jī)鹽，將上述組分溶于配方量的去離子水中，過(guò)濾即得。
[0028] 相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：
[0029] 本發(fā)明所述的培養(yǎng)方法主要是在培養(yǎng)過(guò)程中通過(guò)添加親和劑，改變鴨黃病毒與細(xì) 胞間的微環(huán)境，增加病毒與細(xì)胞間親和度，使鴨黃病毒更加快速地感染生產(chǎn)用細(xì)胞，提高了 鴨黃病毒對(duì)細(xì)胞的感染效率，從而可以在體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中更加快速地獲得高病毒滴度的鴨 黃病毒，為鴨黃病毒的疫苗研發(fā)奠定基礎(chǔ)。
[0030] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 一種提高鴨黃病毒病毒滴度的培養(yǎng)方法，其包括以下步驟：
[0032] A、DMEM培養(yǎng)液的配制：將DMEM干粉溶于去離子水中，攪拌至完全溶解后，調(diào)節(jié)pH 值至6. 8?7. 8,并用0. 22um的無(wú)菌濾膜進(jìn)行除菌過(guò)濾，置于4°C的冰箱待用；
[0033] B、往上述的DMEM溶液中加入占 DMEM培養(yǎng)液體積1 %?8 %的胎牛血清后，接種細(xì) 胞進(jìn)行單層培養(yǎng)；
[0034] C、待單層細(xì)胞培養(yǎng)好后，棄去培養(yǎng)容器內(nèi)的DMEM培養(yǎng)液，并用無(wú)菌洗液洗2?3 次；
[0035] D、棄去無(wú)菌洗液，然后往培養(yǎng)容器內(nèi)加入親和劑和步驟A所述的DMEM培養(yǎng)液，其 中親和劑的體積用量為DMEM培養(yǎng)液體積用量的0. 01%?1% ;
[0036] E、將培養(yǎng)容器置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)Imin?30min后，接種鴨黃病毒，混合 均勻后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2?5天，收獲病毒液。
[0037] 具體地，步驟B中所述的細(xì)胞為Vero細(xì)胞、293細(xì)胞、ST細(xì)胞、BHK細(xì)胞中的一種。
[0038] 具體地，步驟C中所述的無(wú)菌洗液為去離子水、PBS緩沖液、無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液中 的一種。
[0039] 具體地，步驟D中所述的親和劑由以下按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)的各組分制備而成：
[0040] 丙二酸0?1%; 磷酸 0?1%;
[0041] 山梨酸0?0.5%; 蘋(píng)果酸 0.01?1%;
[0042] 無(wú)機(jī)鹽0?3. 5%;去離子水余量。
[0043] 優(yōu)選地，步驟D中所述的親和劑由以下按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)的各組分制備而成：
[0044] 丙二酸 0· 03 ?0· 08% ;磷酸 0.06 ?0.08%;
[0045] 山梨酸0.1?0.3%; 蘋(píng)果酸 0.03?0.08%;
[0046] 無(wú)機(jī)鹽0.05?3%; 去離子水余量。
[0047] 優(yōu)選地，步驟D中所述的親和劑由以下按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)的各組分制備而成：
[0048] 丙二酸 0.05%;磷酸 0.08%;
[0049] 山梨酸0.3%; 蘋(píng)果酸 0.05%;
[0050] 無(wú)機(jī)鹽0.2%; 去離子水99.32%。
[0051] 具體地，所述無(wú)機(jī)鹽為硫酸鈉、磷酸氫二鈉、氯化鉀、氯化鈉中的一種或兩種以上。
[0052] 具體地，所述的硫酸鈉占親和劑總量的0. 15?0. 3% ;所述的磷酸二氫鈉占親和 劑總量的0. 1-1. 6%;所述的氯化鈉占親和劑總量的0. 09-0. 9%;所述的氯化鉀占親和劑總 量的 0. 01-1%。
[0053] 具體地，所述的親和劑是按以下步驟制備而成的：按配方量稱取丙二酸、磷酸、山 梨酸、蘋(píng)果酸、無(wú)機(jī)鹽，將上述組分溶于配方量的去離子水中，過(guò)濾即得。
[0054] 實(shí)施例1 :
[0055] -種提高鴨黃病毒病毒滴度的培養(yǎng)方法，其包括以下步驟：
[0056] A、DMEM培養(yǎng)液的配制：將13. 4g DMEM干粉溶于IOOOml去離子水中，攪拌至完全 溶解后，調(diào)節(jié)PH值至7. 0,并用0. 22um無(wú)菌濾膜進(jìn)行除菌過(guò)濾，置于4°C的冰箱待用；
[0057] B、往上述的DMEM溶液中加入占 DMEM培養(yǎng)液體積5%的胎牛血清后，接種Vero細(xì) 胞進(jìn)行單層培養(yǎng)；
[0058] C、待單層Vero細(xì)胞培養(yǎng)好后，棄去培養(yǎng)容器內(nèi)的DMEM培養(yǎng)液，并用無(wú)菌去離子水 洗3次；
[0059] D、棄去無(wú)菌去離子水，然后往培養(yǎng)容器內(nèi)加入親和劑和步驟A所述的DMEM培養(yǎng) 液，其中親和劑的體積用量為DMEM培養(yǎng)液體積用量的1 % ;
[0060] E、將培養(yǎng)容器置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)30min后，接種鴨黃病毒，混合均勻后 置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，收獲病毒液。
[0061] 具體地，步驟D中所述的親和劑由以下按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)的各組分制備而成：
[0062] 丙二酸 0.5%;磷酸 0.5%;
[0063] 山梨酸0.5%;蘋(píng)果酸 0.5%;
[0064] 無(wú)機(jī)鹽2.9%;去離子水95.5%。
[0065] 其中，所述無(wú)機(jī)鹽為硫酸鈉、磷酸氫二鈉、氯化鉀的混合。
[0066] 其中，所述的硫酸鈉占親和劑總量的0. 3% ;所述的磷酸二氫鈉占親和劑總量的 1.6% ;所述的氯化鉀占親和劑總量的1%。
[0067] 具體地，所述的親和劑是按以下步驟制備而成的：按配方量稱取丙二酸、磷酸、山 梨酸、蘋(píng)果酸、硫酸鈉、磷酸氫二鈉、氯化鉀，將上述組分溶于配方量的去離子水中，過(guò)濾即 得。
[0068] 實(shí)施例2 :
[0069] -種提高鴨黃病毒病毒滴度的培養(yǎng)方法，其包括以下步驟：
[0070] A、DMEM培養(yǎng)液的配制：將13. 4g DMEM干粉溶于IOOOml去離子水中，攪拌至完全 溶解后，調(diào)節(jié)PH值至6. 8,并用0. 22um無(wú)菌濾膜進(jìn)行除菌過(guò)濾，