編碼分泌介導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的雙特異分子的框架及病毒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種編碼分泌介導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的雙特異分子的框架及病毒。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤（tumor，neoplasm)是指細(xì)胞在致瘤因素作用下，基因發(fā)生了改變，失去對其 生長的正常調(diào)控，導(dǎo)致異常增生，可分為良性腫瘤和惡性腫瘤兩大類。良性腫瘤生長緩慢， 與周圍組織界限清楚，不發(fā)生轉(zhuǎn)移，對人體健康危害不大。惡性腫瘤生長迅速，可轉(zhuǎn)移到身 體其它部位，使機體功能失調(diào)，威脅生命。
[0003] 惡性腫瘤也叫癌癥（cancer)，是目前危害人類健康最嚴(yán)重的一類疾病。在美國，惡 性腫瘤的死亡率僅次于心血管疾病而居第二位。據(jù)我國2000年衛(wèi)生事業(yè)發(fā)展情況統(tǒng)計公 報，城市地區(qū)居民死因第一位為惡性腫瘤，其次為腦血管病、心臟病。最為常見和危害性嚴(yán) 重的腫瘤為肺癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、大腸癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌、白血病及淋巴瘤等。
[0004] 雙特異性重組蛋白是含有兩種特異性抗原結(jié)合位點的人工蛋白，能在靶細(xì)胞和功 能分子（細(xì)胞）之間架起橋梁，激發(fā)具有導(dǎo)向性的免疫反應(yīng)，其中利用抗體序列作為導(dǎo)向的 雙特異性抗體是基因工程抗體的一種，現(xiàn)已成為抗體工程領(lǐng)域的熱點，在腫瘤的免疫治療 中具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0005] 雙特異性重組蛋白中比較有效的是介導(dǎo)效應(yīng)T細(xì)胞和殺傷細(xì)胞(如NK細(xì)胞）的 雙特異性重組蛋白。此類雙特異性重組蛋白的一端靶向腫瘤細(xì)胞上面的腫瘤相關(guān)抗原或 MHC-多肽復(fù)合物，另一端靶向殺傷細(xì)胞的表面分子(如⑶3,⑶16,⑶56等)，可以克服MHC限 制性，更大程度的發(fā)揮CTL等殺傷細(xì)胞的功能。雙特異性重組蛋白多為哺乳動物細(xì)胞表達 體系，融合蛋白的表達和純化都相對復(fù)雜，制備成本較高。采用雙特異性重組蛋白治療腫瘤 的局限性在于其半衰期比較短，尤其是對一些小分子蛋白而言，只有幾個小時的半衰期?？?體工程的發(fā)展促使許多新的不同形式的雙特異性重組蛋白的產(chǎn)生，雖然大部分滯留在臨床 前階段，但是仍然有許多分子進入臨床研究階段并展示出良好的治療效果。雙特異性重組 蛋白中，比較引人注目的有triomab和BiTE形式，尤其是catumaxomab在歐洲的批準(zhǔn)后，雙 特異性重組蛋白更成為研究的熱點。除了抗體形式之外，還有許多其他可以特異結(jié)合細(xì)胞 表面受體的蛋白質(zhì)也可以作為重組蛋白的功能區(qū)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種編碼分泌介導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的雙特異分子的框 架及病毒。
[0007] 本發(fā)明提供了一種表達雙特異性重組蛋白的重組病毒；所述雙特異性重組蛋白包 括功能區(qū)甲和功能區(qū)乙；所述功能區(qū)甲特異結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的腫瘤相關(guān)抗原或HLA多肽 復(fù)合物；所述功能區(qū)乙特異結(jié)合T細(xì)胞的表面標(biāo)志物或NK細(xì)胞的表面標(biāo)志物。
[0008] 所述重組病毒具體可為重組腺病毒、重組皰疹病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒。
[0009] 所述功能區(qū)甲包括但不限于特異結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的腫瘤相關(guān)抗原的單區(qū)抗體、 單鏈抗體、Fc片段或受體。所述腫瘤相關(guān)抗原具體可為HER2抗原。所述功能區(qū)甲具體可 如序列表的序列2第246-483位氨基酸殘基所示或序列表的序列4第1-242位氨基酸殘基 所示。
[0010] 所述功能區(qū)甲包括但不限于特異結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的HLA多肽復(fù)合物的單區(qū)抗 體、單鏈抗體、Fc片段或受體。所述HLA多肽復(fù)合物可為HLA-A2多肽復(fù)合物，具體可為 HLA-A2/MDQVPFSV 多肽復(fù)合物(又稱 HLA-A2-MART1 多肽復(fù)合物）或 HLA-A2/ELAGIGILTY 多肽復(fù)合物(又稱HLA-A2-gpl00多肽復(fù)合物)。所述功能區(qū)甲具體可如序列表的序列6第 1-117位氨基酸殘基所示或序列表的序列8第1-125位氨基酸殘基所示。
[0011] 所述功能區(qū)乙可特異結(jié)合T細(xì)胞的表面標(biāo)志物⑶3、NK細(xì)胞的表面標(biāo)志物⑶16或 NK細(xì)胞的表面標(biāo)志物⑶56。
[0012] 所述功能區(qū)乙包括但不限于單區(qū)抗體、單鏈抗體、Fc片段或受體。
[0013] 所述功能區(qū)乙具體可如序列表的序列2第1-243位氨基酸殘基所示、序列表的序 列4第260-502位氨基酸殘基所示、序列表的序列6第137-379位氨基酸殘基所示或序列 表的序列8第145-387位氨基酸殘基所示。
[0014] 所述重組病毒中，所述雙特異性重組蛋白優(yōu)選在腫瘤特異性啟動子的作用下啟動 表達。所述腫瘤特異性啟動子具體可如序列表的序列9所示。
[0015] 所述雙特異性重組蛋白中還可包括檢測標(biāo)簽，如myc標(biāo)簽和/或His標(biāo)簽等。
[0016] 所述雙特異性重組蛋白具體可為序列表的序列2所示的Fcab-anti-⑶3蛋白、序 列表的序列4所示的HER2-anti-⑶3蛋白、序列表的序列6所示的Martl-anti-CD3蛋白或 序列表的序列8所示的GPA-anti-⑶3蛋白。
[0017] 所述重組病毒具體可為將重組質(zhì)粒和質(zhì)粒pBHGlox (delta)El，3Cre導(dǎo)入293A細(xì) 胞并培養(yǎng)細(xì)胞得到的重組病毒；所述重組質(zhì)粒為含有所述雙特異性重組蛋白的編碼基因的 重組表達載體。所述重組質(zhì)粒具體可為將序列表的序列1所示DNA分子、序列表的序列3 所不的DNA分子、序列表的序列5所不的DNA分子或序列表的序列7所不的DNA分子插入 質(zhì)粒TOC316的多克隆位點（如EcoR I和Sal I酶切位點之間）得到的重組質(zhì)粒。
[0018] 本發(fā)明還保護以上任一所述的重組病毒在制備藥物中的應(yīng)用；所述藥物的功能為 如下（a)或（b): (a)治療腫瘤；（b)促進T細(xì)胞或NK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞。所述腫瘤具體可 為肺癌，更具可為肺腺癌。所述腫瘤細(xì)胞可為肺癌細(xì)胞，更具體可為肺腺癌細(xì)胞，更具體可 為A549細(xì)胞或A549-luc細(xì)胞。
[0019] 本發(fā)明還保護一種藥物，其活性成分為以上任一所述的重組病毒；所述藥物的功 能為如下（a)或（b): (a)治療腫瘤；（b)促進T細(xì)胞或NK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞。所述腫瘤具 體可為肺癌，更具可為肺腺癌。所述腫瘤細(xì)胞可為肺癌細(xì)胞，更具體可為肺腺癌細(xì)胞，更具 體可為A549細(xì)胞或A549-luc細(xì)胞。
[0020] 采用腺病毒作為載體的優(yōu)勢如下：（1)借助腺病毒載體表達的融合蛋白的翻譯后 修飾同人體的天然蛋白是一致的，可以降低融合蛋白的免疫原性；（2)能感染大多數(shù)哺乳 動物細(xì)胞，包括分裂和不分裂的；（3)有較大的容量(約8kb); (4)有較高的重組蛋白表達水 平，滴度高；（5)不整合；（6)毒性較小。
[0021] 本發(fā)明提供的重組腺病毒侵染腫瘤細(xì)胞之后，腫瘤細(xì)胞就變成了融合蛋白（雙特 異性重組蛋白）表達的工廠，與直接給予融合蛋白相比可以減少治療次數(shù)(僅一次注射腺病 毒即可維持至少兩周的融合蛋白表達時間)，通過原位注射的方式將腺病毒導(dǎo)入腫瘤，表達 的融合蛋白可以立即與腫瘤細(xì)胞結(jié)合，無需經(jīng)過體內(nèi)代謝，相比直接注射融合蛋白而言，效 率更_，一旦腫瘤周圍有效應(yīng)細(xì)胞的存在可以立即進行殺傷。
[0022] 本發(fā)明將雙特異性重組蛋白介導(dǎo)的高效殺瘤作用以及腺病毒載體非整合性持續(xù) 表達融合蛋白的特點相結(jié)合，利用復(fù)制缺陷型腺病毒載體將雙特異性重組蛋白的編碼基因 導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，從而使腫瘤細(xì)胞持續(xù)的表達融合蛋白，高效的介導(dǎo)殺傷細(xì)胞有效殺傷腫瘤 細(xì)胞。本發(fā)明對于腫瘤治療具有重大價值。
【附圖說明】
[0023] 圖1為質(zhì)粒H)C316的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0024] 圖2為實施例1的步驟一的4中，37°C培養(yǎng)7天左右的細(xì)胞病變照片。
[0025] 圖3為實施例1的步驟五中重組病毒的鑒定結(jié)果。
[0026] 圖4為實施例1的步驟五中排除野生型腺病毒的鑒定結(jié)果。
[0027] 圖5為實施例1的步驟六中Western blot的結(jié)果。
[0028] 圖6為實施例1的步驟七中殺傷實驗的結(jié)果。
【具體實施方式】
[0029] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平 均值。
[0030] ADmax腺病毒包裝系統(tǒng)購自加拿大Microbix公司，含有質(zhì)