一種從人凝血因子Ⅸ層析廢液中激活制備人凝血酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種從人凝血因子IX層析廢液中激活制備人凝 血酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人凝血酶是一種快速止血藥，由人凝血酶原（人凝血因子II)激活而來(lái)，凝血酶本 身適用于結(jié)扎止血困難的小血管、毛細(xì)血管以及實(shí)質(zhì)性臟器出血的止血；用于外傷、手術(shù)、 口腔、耳鼻喉、泌尿、燒傷、骨科等出血的止血，既可以單獨(dú)成藥，也可和人纖維蛋白原組合 成人纖維蛋白膠。
[0003] 人凝血酶的生產(chǎn)工藝方面的研究主要有：Philip K?等：A novel one-step purification of human a -thrombin after direct activation of crude prothrombin enriched from plasma，Biochem，J. (1991)280,805-808,作者同樣以人血楽為原料，經(jīng) BaC12吸附，（NH4)2S04沉淀，得到粗品人凝血酶原后，用太攀蛇蛇毒作激活劑，激活 人凝血酶原成為凝血酶，然后經(jīng)過(guò)Heparin Sepharose CL6B肝素親和層析，獲得人凝血 酶；鐘峻等：高純度人凝血酶的制備，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，1995年第17卷第1期36-40 頁(yè)報(bào)道了人凝血酶的制備方法。作者以人血漿為原料，經(jīng)BaC12吸附，（NH4)2S04沉淀， 得到粗品人凝血酶原后，用人腦粉作激活劑，激活人凝血酶原酶原成為凝血酶，然后 經(jīng)過(guò)Amberllte CG-50、SP-Sephadex C-50兩次離子交換層析，得到電泳純、比活性可達(dá) 2000NIH U/mg 的人凝血酶。Kingdom et al. U.S. Pat. No. 5,354,682 (1994)公開(kāi)了一種 以人去冷沉淀血楽為原料，經(jīng)DEAE-Agarose或DEAE-Sepharose凝膠吸附，然后用從兔腦 中提取的促凝血酶原激酶激活人凝血酶原為人凝血酶，S/D滅活后，使用S-S印harose層析 + 反向?qū)游黾兓@得人凝血酶。Metzner et al. U.S.Pat.No. US8,012,728 B2 (2011)公 開(kāi)了一種以粗純或者中純?nèi)四?不加入thromboplastin作為激活劑，但未公開(kāi)具體的 激活方式）為原料，經(jīng)疏水層析，病毒滅活，還可以加上/或者不加陽(yáng)離子交換層析，獲得高 純?nèi)四傅姆椒ā?br>[0004] -方面，傳統(tǒng)的激活方式一般是以促凝血酶原激酶（Thromboplastin, -般為動(dòng) 物腦組織或其他組織提取物或者人腦粉等）或者蛇毒作為激活劑，即使經(jīng)過(guò)后續(xù)的純化， 仍無(wú)法避免成品中含有核酸或者動(dòng)物源蛋白及核酸等，仍存在一定的安全隱患。另一方 面，由于人凝血酶原是國(guó)內(nèi)治療乙型血友病的特效藥人凝血酶原復(fù)合物（Prothrombin Concentration Complex, PCC)的組成成分之一，兩種產(chǎn)品無(wú)法同時(shí)制備，所以國(guó)內(nèi)臨床基 本無(wú)人凝血酶的應(yīng)用。隨著國(guó)內(nèi)純化技術(shù)的逐步提高，目前國(guó)內(nèi)已有廠家在進(jìn)行從PCC中 分離純化人凝血因子IX的研究，以代替PCC治療乙型血友病，在此過(guò)程中，人凝血酶原在層 析廢液中作為雜質(zhì)蛋白被廢棄，十分可惜。由于人凝血因子IX層析流穿液中已基本不含人 凝血因子IX，人凝血酶原的激活途徑被打破，很難被激活為人凝血酶。而且，人凝血酶對(duì)比 動(dòng)物源凝血酶的最大優(yōu)勢(shì)就是不含動(dòng)物蛋白質(zhì)及核酸等。因此本發(fā)明提供了一種能綜合利 用血漿資源，將人凝血因子IX層析廢液變廢為寶，不引入動(dòng)物源物質(zhì)，激活制備人凝血酶的 方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種從人凝血因子IX層析廢液中激活制備人凝血酶的方 法。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案為： 一種從人凝血因子IX層析廢液中激活制備人凝血酶的方法，包含以下步驟： (1)層析廢液激活 將人凝血因子IX層析廢液中加入1%-10%PCC，1%-5%人凝血因子VIL 10-30mmol/L CaCl2,10-30°C孵放1-6小時(shí)，進(jìn)行激活，激活前后人凝血酶活性/人凝血酶原活性比例為 100-150。
[0007] (2)凝血酶純化 將上步驟所得激活后的溶液過(guò)Heparin親和凝膠進(jìn)行吸附，以0. 1-0. 5mol/L枸 櫞酸鈉，〇. 1-0. 5mol/L氯化鈉溶液pH7. 0±0. 5洗脫獲得人凝血酶，人凝血酶比活性達(dá) 1000-2000IU/mg。
[0008] (3)凍干及干熱 將上步驟中洗脫液超濾透析至電導(dǎo)率5-30mS/cm，pH7. 0±0. 5,凍干；凍干結(jié)束后進(jìn)行 100°C干熱滅活30分鐘，獲得凝血酶產(chǎn)品。
[0009] 本發(fā)明的從人凝血因子IX層析廢液中激活制備人凝血酶的方法，是將獲得人凝血 因子IX產(chǎn)品后的層析廢液中，進(jìn)行后續(xù)處理而得到。
[0010] 對(duì)于本發(fā)明中獲得人凝血因子IX產(chǎn)品后的層析廢液的步驟如下： a. 獲得PCC粗品 將人血漿調(diào)整pH至7. 0±0· 5,按1-1. 5g/L比例加入DEAE S印hadex A-50凝膠，吸附 30-60分鐘；以10-30mmol/L枸櫞酸鈉，100-200mmol/L氯化鈉溶液，pH7. 0±0. 5洗滌雜蛋 白，以10-30mmol/L枸櫞酸鈉，l-2mol/L氯化鈉溶液，pH7. 0±0. 5洗脫，洗脫液經(jīng)超濾脫鹽 至電導(dǎo)率10-30mS/cm，即為PCC粗品； b. S/D病毒滅活 將步驟a所得PCC粗品中按1 :9比例加入S/D試劑，24土 1°C，孵放360min，滅活脂包 膜病毒； c. 獲得人凝血因子IX產(chǎn)品及其層析廢液 將步驟b所得病毒滅活后PCC粗品過(guò)Heparin親和凝膠進(jìn)行層析吸附，以0. 1-0. 5mol/ L枸櫞酸鈉，0. 5-lmol/L氯化鈉溶液pH7. 0±0. 5洗脫獲得人凝血因子IX產(chǎn)品，產(chǎn)生的廢液 即層析廢液。
[0011] 作為優(yōu)選， 步驟a中DEAE Sephadex A-50應(yīng)在溶脹及平衡后使用，溶脹參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，平衡液 為 10-30mmol/L 枸櫞酸鈉，50-80mmol/L 氯化鈉溶液，pH7. 0±0. 5。
[0012] 步驟a中超濾脫鹽的同時(shí)進(jìn)行濃縮，所得的PCC粗品中凝血酶原的活性為 10-30IU/ml〇
[0013] 步驟b中的S/D試劑可為T(mén)ween-80/TnBP或者Triton X-100/TnBP，使用前進(jìn)行預(yù) 配，預(yù)配濃度為l〇%/3% (w/v)。
[0014] 步驟 c 與步驟⑵中的 Heparin 親和凝膠為 Heparin Sepharose FF、Heparin Sepharose 6FF、Heparin Sepharose CL6B、CaptoHeparin、AF-Heparin HC-650M、Heparin Hyper D等Heparin親和凝膠中的任意一種。
[0015] 步驟c中層析廢液可以為層析流穿液、層析洗滌液、層析高鹽處理液中的一種或 者任意幾種的組合。
[0016] 步驟1中的人凝血因子VIL可以為人凝血因子VDI成品，也可為人凝血因子VDI干熱 滅活前的半成品，優(yōu)選干熱滅活前的半成品。
[0017] PCC應(yīng)為人凝血酶原復(fù)合物，可以為PCC成品，也可以為步驟a中獲得PCC粗品，優(yōu) 選PCC粗品。
[0018] 步驟1中PCC加入比例（1%-10%)為加入的總凝血酶原活性/步驟3所得廢液總凝 血酶原活性；人凝血因子VDI的加入比例（1%_5%)為加入的總?cè)四蜃覸DI活性/步驟3所 得廢液總凝血酶原活性。