hCBS酶特異性抑制劑的結(jié)合靶標及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種酶特異性抑制劑的結(jié)合靶標及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 人體內(nèi)源性的H2S氣體分子參與并調(diào)控很多生理和病理過程，為重要的信號轉(zhuǎn)導 通路的調(diào)控分子。在結(jié)腸癌、神經(jīng)退行性疾病、缺血性中風、低血壓、高血壓和胰腺炎等很多 病理條件下，內(nèi)源性H 2S含量都發(fā)現(xiàn)有異常變化。因此，目前需要內(nèi)源性H2S信號的特異抑 制劑或激活劑作為分子探針工具去進一步闡述H 2S的生理功能，和治療與H2S-相關(guān)的疾病 的小分子藥物先導物。
[0003] CBS (cystathionine β-synthase,胱硫醚-β -合成酶）酶是一種 PLP-依賴型 (pyridoxal-5' -phosphate-dependent)酶，即維生素 B6依賴型酶。在人體內(nèi)，CBS酶催化 底物L-半胱氨酸（Cysteine)和L-同型半胱氨酸（L-Homocysteine)產(chǎn)生內(nèi)源性H 2S氣體。 在循環(huán)休克、中風、唐氏綜合癥病人和癌癥病人或模型動物的體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)過量的H2S和/或 CBS活性的增強，因此，hCBS (human CBS)酶和hCSE酶已經(jīng)被認為是治療循環(huán)休克、中風、 唐氏綜合癥和腫瘤的潛在靶標。
[0004] 已知的hCBS酶小分子抑制劑，不僅與酶的結(jié)合力弱而且選擇性也很低，因為他們 對其它維生素 B6-依賴型酶也有抑制作用。因此，急需篩選出特異性的hCBS酶抑制劑，可 作為'工具藥'（as tools)去證實已發(fā)現(xiàn)的H2S的生物學效應(yīng)和信號通路作用，同時也可作 為藥物研發(fā)的先導化合物。
[0005] 目前，酶抑制劑的發(fā)現(xiàn)主要通過兩種方法，即生物篩選和合理藥物設(shè)計。基于靶點 的合理藥物設(shè)計就是通過對藥物作用的靶點進行研究，找到新的、合適的藥物來治療某些 疾病。發(fā)現(xiàn)一個的靶點往往就能設(shè)計出一類新藥，在新藥研究領(lǐng)域也是極受重視的。
[0006] 深入認識酶結(jié)構(gòu)，特別是當它與特異性抑制劑復合時的結(jié)構(gòu)，將會產(chǎn)生一種鑒定 該酶中結(jié)合位點的方法，并獲得酶/抑制劑復合物以及該酶中敏感殘基的構(gòu)象，這些知識 對藥物設(shè)計和優(yōu)化方法來講都是至關(guān)重要的。
[0007] hCBS和hCSE的純酶3D晶體結(jié)構(gòu)已被報道，這為其靶向抑制劑的設(shè)計提供了一定 的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，但是與底物-結(jié)合相關(guān)的氨基酸殘基還不清楚。
[0008] 因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員致力于研究hCBS的特異性抑制劑和其與hCBS的結(jié)合位 點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明中所用縮寫如下：
[0010] hCBS 指人源胱硫醚-β -合成酶，即 human cystathionine β -synthase ;
[0011] hDDC 指人多巴脫羧酶，即 human dopa decarboxylase ;
[0012] DTNB 指 5, 5'-二硫代二（2-硝基苯甲酸)，即 5, 5'-Dithio bis-(2_nitrobenzoic acid)；
[0013] Tris-HCl 指三輕甲基氨基甲燒鹽酸鹽，即 Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride；
[0014] EDTA 指乙二胺四乙酸，即 Ethylene Diamine Tetraacetic Acid ;
[0015] L-Cys 指 L-半胱氨酸，即 L-Cysteine ;
[0016] D, L-HCys 指 D, L-同型半胱:氛酸，即 D, L-Homocysteine ;
[0017] SAM 指 S-腺苷甲硫氨酸，即 S-adenosyl methionine ;
[0018] PLP 指憐酸批咳醒，即 pyridoxal-5' -phosphate ;
[0019] 7_ 氛基-2-輕基-5-亞氛基 _6, 7_ 二氧喧琳 _8 (5H)-麗，即 7-amin〇-2-hydrox y-5-imin〇-6, 7-dihydroquinolin-8(5H)-one ；
[0020] 1,6 -二甲基〔1,2,4〕三嗪并[5,4-e]-5,7 (1H，6H)_ 嘧啶二酮，艮P I, 6-dimethylpyrimido [5, 4-e] [I, 2, 4] triazine-5, 7 (1H, 6H)-dione ；
[0021] 2_ 氯-3- (4-甲基哌陡-I-基）萘-I, 4_ 二酮，即 2_chlor〇-3-(4-methylpiperi din-l-yl)naphthalene-1, 4-dione ；
[0022] 喹哪陡藍，即 quinaldine blue ;
[0023] HepG2 細胞指人肝癌細胞系，即 a human liver carcinoma cell line ;
[0024] 本發(fā)明中所提到的酶促反應(yīng)容器能夠容納H2S氣體檢測器，即氣體檢測容器能夠 置入酶促反應(yīng)容器中，以使酶促反應(yīng)產(chǎn)生的H 2S氣體能夠全部擴散進入檢測體系。
[0025] 本發(fā)明公開了一種hCBS酶特異性抑制劑的結(jié)合靶標，其所述hCBS酶的氨基酸序 列如序列表SEQ ID No. 1所示；所述靶標的氨基酸殘基為：
[0026] Lysll9,Prol45, Thrl46,Serl47,Glyl48, Asnl49,Thrl50,Glyl51, Metl73,Lysl 77,Prol70, His202, Val204, Ser285, Thr299, Thr300, Tyr301, Val303, Gly304, Gly305, Il e306,Gly307, Tyr308, Asp309, Phe310。
[0027] 本發(fā)明的另一個方面公開了所述結(jié)合靶標在開發(fā)特異性抑制hCBS酶促反應(yīng)的藥 物中的應(yīng)用，其中所述藥物是指能夠特異性抑制hCBS酶促反應(yīng)產(chǎn)生H 2S的小分子化合物。
[0028] 優(yōu)選地，所述小分子化合物是指7-氨基-2-羥基-5-亞氨基-6, 7-二氫喹 啉-8(5H)_酮、1，6_二甲基[1，2,4]三嗪并[5,4-6]-5,7(1!1，6!1)-嘧啶二酮、喹哪啶藍和 2_氯-3-(4-甲基哌啶-1-基）萘-1，4-二酮。
[0029] 本發(fā)明中，用Compd. 1指代7-氨基-2-羥基-5-亞氨基-6, 7-二氫喹 啉-8 (5H)-酮；用 Compel· 2 指代 1，6 -二甲基[1，2, 4]三嗪并[5, 4-e] -5, 7 (1H，6H)-嘧啶二 酮；用Compd. 3指代喹哪啶藍；用Compd. 4指代2-氯-3-(4-甲基哌啶-1-基）萘-1，4-二 酮。
[0030] Compd. 1，Compd. 2, Compd. 3 和 Compd. 4 對 hCBS 以及 hDDC 酶促反應(yīng)的 IC5tl 如表 1 所示，由表1可以看出，這四個化合物在hCBS和hDDC之間具有大于8倍的選擇性。由于測 定hDDC活性時，酶反應(yīng)液中含有其它兩種偶聯(lián)酶，即蘋果酸脫氫酶和丙酮酸羧化酶，因此