一種檢測(cè)細(xì)菌喹諾酮類耐藥基因的引物及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)細(xì)菌喹諾酮類耐藥基因的引 物及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 喹諾酮類是近年來臨床引用較廣的一種新型廣譜抗菌劑，是人工合成的含4-喹 諾酮基本結(jié)構(gòu)的抗菌藥。喹諾酮類和其他抗菌藥的作用點(diǎn)不同，它們以細(xì)菌的脫氧核糖核 酸（DNA)為靶。細(xì)菌的雙股DNA扭曲成為袢狀或螺旋狀（稱為超螺旋），使DNA形成超螺旋 的酶稱為DNA回旋酶，喹諾酮類妨礙此種酶，進(jìn)一步造成細(xì)菌DNA的不可逆損害，而使細(xì)菌 細(xì)胞不再分裂。
[0003] 喹諾酮類抗生素在臨床上不僅對(duì)革蘭氏陰性菌有較強(qiáng)的抗菌作用，而且對(duì)革蘭陽 性菌也有較強(qiáng)的抗菌作用。由于具有抗菌作用強(qiáng)、感染部位濃度高、不良反應(yīng)輕微、血半衰 期長、使用方便、患者耐受性好及價(jià)格相對(duì)較低等特點(diǎn)，使其在細(xì)菌性感染治療中具有一定 的優(yōu)勢(shì)。普遍用于傷寒、急性細(xì)菌性痢疾、單純尿道感染、急性淋病性尿道炎、急性呼吸道感 染、軍團(tuán)病、肺結(jié)核等。另外，近年來喹諾酮類抗生素在兒科領(lǐng)域也得到了廣泛應(yīng)用，此外， 喹諾酮類抗生素是一類人畜通用的藥物。因其具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、與其他抗菌藥 物無交叉耐藥性和毒副作用小等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于畜牧、水產(chǎn)等養(yǎng)殖業(yè)中，包括在雞、鴨、 鵝、豬、牛、羊、魚、蝦、蟹等的養(yǎng)殖中用于疾病防治。
[0004] 近30年來，由于大量治療用抗生素在臨床的不合理應(yīng)用，臨床疾病相關(guān)細(xì)菌的耐 藥性不斷增加，引起正常菌群失調(diào)和大量耐藥菌株出現(xiàn)。耐藥菌能夠承受住抗生素藥物的 攻擊，這樣一來標(biāo)準(zhǔn)的治療就失去了效果，感染持續(xù)存在并可傳染他人。喹諾酮類抗菌藥由 于其高效的抗菌活性，已被越來越多的使用于臨床，這當(dāng)中不免有抗生素濫用的情況，并且 其耐藥機(jī)制多樣，使得此類藥物的耐藥性問題也日益突出。另外，因?yàn)樵谛竽琉B(yǎng)殖業(yè)中廣泛 使用喹諾酮類抗生素的情況非常普遍，不僅動(dòng)物、禽類及魚類體內(nèi)殘留的抗生素會(huì)轉(zhuǎn)移到 人體，它們體內(nèi)產(chǎn)生的耐藥菌和耐藥基因也會(huì)傳播給人類。這樣就需要一種能方便快捷的 檢測(cè)細(xì)菌耐藥性的方法，從而來及早發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)菌，進(jìn)而改變用藥方案，指導(dǎo)臨床治療。
[0005] 耐藥性的檢測(cè)可以分為常規(guī)表型檢測(cè)（即藥敏試驗(yàn)）和耐藥基因型檢測(cè)。常規(guī)藥 敏試驗(yàn)首先需要通過培養(yǎng)的方法從臨床標(biāo)本中分離到菌株，而許多生長較慢和不易培養(yǎng)的 細(xì)菌，是無法通過常規(guī)藥敏試驗(yàn)檢測(cè)其耐藥性的。在過去的20年，為適應(yīng)臨床需要，以DNA 探針和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)為基礎(chǔ)的分子手段檢測(cè)耐藥基因取得了很大進(jìn)展，其中部分方 法已被美國食品和藥品管理局（FDA)批準(zhǔn)用于臨床工作。從最初的定性PCR和電泳到后期 的基因芯片等技術(shù)都可以檢測(cè)細(xì)菌抗生素相關(guān)耐藥基因，但定性PCR及電泳法具有容易污 染、操作繁瑣等缺陷，基因芯片技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)耐藥基因，但成本也非常高，操作復(fù)雜， 所需時(shí)間長，不適宜臨床大規(guī)模推廣應(yīng)用。
[0006] 實(shí)時(shí)突光定量 PCR 技術(shù)（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction 簡(jiǎn)稱Real Time PCR)是在定性PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)，在PCR反應(yīng)體系 中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì) 樣品中的DNA(或cDNA)進(jìn)行定量檢測(cè)的方法。該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA/RNA模板的定量， 而且具有靈敏度和特異性高、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、自動(dòng)化程度高、無污染、成本低廉等特點(diǎn)。目 前已有多種運(yùn)用定量PCR技術(shù)的試劑盒應(yīng)用于臨床疾病相關(guān)的病原體檢測(cè)、基因分型、突 變研究等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是，提供一種靈敏、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便的新型檢測(cè)試劑 盒，實(shí)現(xiàn)對(duì)常見細(xì)菌喹諾酮類耐藥基因 qnrA、qnrB、qnrS的快速檢測(cè)，以彌補(bǔ)現(xiàn)有檢測(cè)方法 的不足。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0009] 檢測(cè)細(xì)菌喹諾酮類耐藥基因的引物，它包括如下引物：
[0010] ⑴擴(kuò)增qnrA耐藥基因的引物對(duì)，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1?2所示；
[0011] ⑵擴(kuò)增qnrB耐藥基因的引物對(duì)，其核苷酸序列如SEQ ID NO :3?4所示；
[0012] ⑶擴(kuò)增qnrS耐藥基因的引物對(duì)，其核苷酸序列如SEQ ID NO :5?6所示；
[0013] 上述3對(duì)引物對(duì)在一次檢測(cè)中共同使用。
[0014] 上述檢測(cè)細(xì)菌喹諾酮類耐藥基因的引物在制備檢測(cè)細(xì)菌喹諾酮類耐藥基因試劑 中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0015] 一種檢測(cè)細(xì)菌喹諾酮類耐藥基因的試劑盒，該試劑盒包括如下試劑：
[0016] (I)PCR反應(yīng)液：該P(yáng)CR反應(yīng)液中含有DNA聚合酶、EvaGreen熒光染料、Mg2+、PCR反 應(yīng)緩沖液、dATP、dCTP、dTTP 和 dGTP ;
[0017] (2)引物混合液：將SEQ ID NO :1?6所示的6種引物混合，用雙蒸水溶解，每條 引物的濃度為lymol/L ;
[0018] (3)陽性對(duì)照：分別含有qnrA、qnrB、qnrS耐藥基因的三種細(xì)菌基因組DNA和大腸 桿菌基因組DNA的水溶液；
[0019] (4)陰性對(duì)照：大腸桿菌基因組DNA的水溶液。
[0020] 其中，陽性對(duì)照中，每一種含耐藥基因的細(xì)菌基因組DNA濃度為IOng/ μ L，大腸桿 菌基因組DNA濃度為50ng/ μ L。
[0021] 其中，陰性對(duì)照中，大腸桿菌基因組DNA的濃度為100ng/Ml。
[0022] 上述的檢測(cè)細(xì)菌喹諾酮類耐藥基因的試劑盒在制備細(xì)菌喹諾酮類耐藥基因檢測(cè) 試劑中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0023] 因?yàn)榧?xì)菌的生長繁殖速度很快，其基因組也經(jīng)常會(huì)發(fā)生變異而具有異質(zhì)性，包含 本發(fā)明所述的3種耐藥基因 qnrA、qnrB、qnrS的不同種類的臨床致病菌和同一種菌的不 同臨床隔離菌株所含的基因 DNA序列會(huì)有所差異，本發(fā)明通過從NCBI的基因序列庫中比 對(duì)多種菌及臨床隔離株的基因序列，在保守位點(diǎn)設(shè)計(jì)的特異性引物能擴(kuò)增臨床常見致病菌 (主要包括革蘭氏陰性桿菌和革蘭氏陽性球菌，如大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、 陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌、金黃色葡萄球菌、粘質(zhì)沙雷菌、奇異變形桿 菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌等）的qnrA、qnrB、qnrS耐藥基因。
[0024] 有益效果：
[0025] (1)本發(fā)明通過對(duì)臨床多種細(xì)菌及隔離株的喹諾酮類耐藥基因 qnrA、qnrB、qnrS 的序列進(jìn)行分析，選取保守序列設(shè)計(jì)引物，能特異性擴(kuò)增臨床常見致病菌的喹諾酮類耐藥 基因 qnrA、qnrB、qnrS〇
[0026] (2)在檢測(cè)喹諾酮類耐藥基因試劑盒中加入穩(wěn)定性強(qiáng)、雙鏈結(jié)合特異性高、對(duì)PCR 反應(yīng)抑制小的EvaGreen熒光染料，能快速、準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增出喹諾酮類耐藥基因。
[0027] (3)本發(fā)明所述的核酸序列和試劑盒具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低 廉及高通量等優(yōu)點(diǎn)，可用于輔助臨床快速診斷致病性細(xì)菌喹諾酮類耐藥基因的耐藥情況， 為臨床治療提供參考依據(jù)。
【附圖說明】
[0028] 圖1為陽性對(duì)照品檢測(cè)結(jié)果圖。
[0029] 圖2為陰性對(duì)照品檢測(cè)結(jié)果圖。
[0030] 圖3為1例大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥大腸桿菌的耐藥基因檢測(cè)結(jié)果圖。
[0031] 圖4為1例大環(huán)內(nèi)酯類抗生素敏感肺炎克雷伯菌檢測(cè)結(jié)果圖。
[0032] 圖中英文字母對(duì)應(yīng)的中文名稱為：
[0033] Cycles :循環(huán)數(shù)；Fluorescence :突光值；Amplification Curves :擴(kuò)增曲線； Select :選擇；Zoom :放大。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本 發(fā)明。
[0035] 實(shí)施例1 :檢測(cè)細(xì)菌喹諾酮類3種耐藥基因耐藥基因 qnrA、qnrB、qnrS的核酸序 列。3對(duì)特異性引物委托英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成：
[0036] 擴(kuò)增qnrA耐藥基因的引物對(duì)：
[0037] F1(SEQ ID NO :1) :5，-TTTGATGGTTGCCGCTTTGTC-3，，
[0038] R1(SEQ ID NO ：2) ：5' -CTCT