抑制cd44基因的寡聚核酸及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一類抑制CD44基因的寡聚核酸及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨關(guān)節(jié)炎（OA)是世界上致殘的重要原因之一，大約多于10%的老年人有骨關(guān)節(jié) 炎的癥狀。風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA)是一個(gè)慢性炎癥疾病，影響著世界上約0.5%到1 %的成年 人，通常導(dǎo)致關(guān)節(jié)損壞并危及生活質(zhì)量。多種炎性細(xì)胞因子如TNF-a . IL-L IL-6等參與了 RA和OA的發(fā)病和進(jìn)展，其通過(guò)激活免疫細(xì)胞及誘導(dǎo)金屬蛋白酶產(chǎn)生而促進(jìn)關(guān)節(jié)破壞、滑膜 炎、血管增生等。多種炎性細(xì)胞因子如TNF-a . IL-L IL-6等參與了 RA和OA的發(fā)病和進(jìn)展， 其通過(guò)激活免疫細(xì)胞及誘導(dǎo)金屬蛋白酶產(chǎn)生而促進(jìn)關(guān)節(jié)破壞、滑膜炎、血管增生等。
[0003] ⑶44分子是廣泛表達(dá)于細(xì)胞表面的I類跨膜單鏈糖蛋白，其分布包括淋巴細(xì)胞、 單核細(xì)胞、紅細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞等。CD44 分子最初作為粘附分子，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用，隨著研 究發(fā)現(xiàn)，CD44分子也可以參與細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)，并與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移以及造血干 細(xì)胞的歸巢等密切相關(guān)；研究表明CD44作為多種腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物，是潛在的腫瘤治療 靶點(diǎn)，且CD44的生物學(xué)功能及其表達(dá)調(diào)控模式因腫瘤種類以及生長(zhǎng)條件的不同而有所不 同.另外，CD44還與炎癥因子的釋放、淋巴細(xì)胞的激活、傷口的愈合、自身免疫病等相關(guān)。
[0004] 在過(guò)去的20多年里，大多數(shù)新型治療方法的研發(fā)工作是關(guān)于疾病緩解的抗關(guān)節(jié) 炎藥物（DMRDs)和疾病緩解的抗風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物（DMOADs)。到目前為止，制藥業(yè)在研 制有效安全的疾病緩和性藥物（DMOADs)上并不成功，致使成千上萬(wàn)的病人仍受到該嚴(yán)重 致殘性疾病所帶來(lái)的痛苦。隨著新途徑和給藥方法的應(yīng)用，在該治療領(lǐng)域預(yù)期將有更多的 發(fā)展，這為可阻斷、逆轉(zhuǎn)疾病過(guò)程并緩和疾病的藥物，如siRNA提供了巨大的發(fā)展空間。
[0005] RNA干預(yù)是生命科學(xué)上具革命意義的發(fā)現(xiàn)，成為研究基因功能的重要工具，它能夠 導(dǎo)致生物體，哺乳動(dòng)物細(xì)胞，甚至動(dòng)物中的基因失活。RNA干預(yù)技術(shù)可應(yīng)用于治療有關(guān)有害 基因過(guò)度表達(dá)的疾病，具有創(chuàng)造人類疾病治療新方法的潛力。
[0006] 在本發(fā)明中，我們提供一種全新的siRNA作為關(guān)節(jié)炎及相關(guān)炎癥的治療藥物；一 種通過(guò)骨關(guān)節(jié)腔局部注射siRNA及其制劑抑制炎癥因子表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)關(guān)節(jié)炎癥的治療作 用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明目的旨在提供一類抑制⑶44基因表達(dá)的寡聚核酸。
[0008] 實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
[0009] -類抑制CD44基因的寡聚核酸，所述寡聚核酸為雙鏈RNA，所述寡聚核酸的堿基 組成為：
[0010] 包括有⑴含有SEQ. ID NO. 18所示的70%以上同源的反義鏈；（2)含有與⑴所 述反義鏈反向互補(bǔ)配對(duì)的寡聚核酸50%以上序列同源的正義鏈；且（3)所述（1)和（2)寡 聚核酸經(jīng)過(guò)退火后能形成雙鏈結(jié)構(gòu)。
[0011] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述寡聚核酸包括有（1)由SEQ. ID NO. 18堿基序列所示的 反義鏈；⑵含有SEQ. ID NO. 17所示至少50%序列同源構(gòu)成的正義鏈；且⑶正義鏈和反 義鏈經(jīng)過(guò)退火后能形成雙鏈結(jié)構(gòu)。
[0012] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述寡聚核酸包括有（1)含有SEQ. ID NO. 18所示至少70% 序列同源構(gòu)成的反義鏈；（2)由SEQ. ID NO. 17堿基序列所示的正義鏈；且（3)正義鏈和反 義鏈經(jīng)過(guò)退火后能形成雙鏈結(jié)構(gòu)。
[0013] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述寡聚核酸包括有（1)含有SEQ. ID NO. 18所示至少70% 序列同源構(gòu)成的反義鏈；（2)含有SEQ. ID NO. 17所示至少70%序列同源構(gòu)成的正義鏈；且 (3)正義鏈和反義鏈經(jīng)過(guò)退火后能形成雙鏈結(jié)構(gòu)。
[0014] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述寡聚核酸由堿基組成如SEQ. ID NO. 18所示的反義鏈以 及堿基組成如SEQ. ID NO. 17所示的正義鏈組成。
[0015] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述寡聚核酸由堿基組成如siRNA-⑶-28、siRNA-⑶-36、 siRNA-CD-39、siRNA-CD-40、siRNA-CD-41、siRNA-CD-42 所示。
[0016] 本發(fā)明提供寡聚核酸是雙鏈RNA，其中所述雙鏈RNA中的特征為：反義鏈含有核苷 酸序列為"51衝此(：呢464(^呢(^63'"如序列表中序列18，或與其具有至少70%以上同源 性的同源序列；正義鏈含有與反義鏈反向互補(bǔ)鏈具有50%同源性以上的核苷酸序列。上述 寡聚核酸可經(jīng)過(guò)（1)-(4)中任一種或多種修飾：
[0017] 1)對(duì)所述寡聚核酸的連接核苷酸的磷酸二酯鍵進(jìn)行修飾，優(yōu)選將所述磷酸二酯鍵 的氧用硫取代；
[0018] 2)對(duì)所述寡聚核酸的所含核糖進(jìn)行修飾，優(yōu)選將核糖2'_0H用甲氧基或氟取代或 者對(duì)所述2' -OH進(jìn)行脫氧修飾，或以開(kāi)環(huán)核酸（UNA)進(jìn)行修飾；
[0019] 3)對(duì)所述寡聚核酸的核苷酸堿基的修飾，優(yōu)選胞嘧啶5位甲基修飾、5-乙炔基尿 嘧啶、吲哚修飾；
[0020] 4)對(duì)所述寡聚核酸末端修飾，優(yōu)選末端連接膽固醇、多肽、熒光、糖、抗體分子、磷 酸化修飾；
[0021] 5)本發(fā)明所述寡聚核酸在3'末端可以添加懸掛堿基，優(yōu)選懸掛堿基為dTdT。
[0022] 本發(fā)明的另一目的還在于提供一種有抑制⑶44基因表達(dá)功能的DNA。
[0023] 具體技術(shù)方案如下。
[0024] 可表達(dá)上述任一種寡聚核酸且具有抑制⑶44基因表達(dá)功能的DNA。
[0025] 本發(fā)明的另一目的還在于提供一種具有抑制⑶44基因表達(dá)功能的載體。
[0026] 具體技術(shù)方案如下。
[0027] 含有上述任一種寡聚核酸或者上述DNA的載體，所述載體為脂質(zhì)體、聚合物材料、 多肽、納米材料。其中脂質(zhì)體載體材料為本領(lǐng)域常用的陽(yáng)離子脂質(zhì)體，優(yōu)選lip〇2000 ;聚合 物載體材料優(yōu)選透明質(zhì)酸或聚賴氨酸；多肽材料優(yōu)選RGD ;納米材料優(yōu)選為殼聚糖納米粒。
[0028] 本發(fā)明的另一目的還在于提供一種具有抑制⑶44基因表達(dá)功能的組合物。具體 技術(shù)方案如下。
[0029] -種具有抑制⑶44基因表達(dá)功能的組合物，含有上述任一種寡聚核酸或者上述 DNA，以及藥學(xué)上可接受的載體。
[0030] 本發(fā)明的另一目的還在于提供上述寡聚核酸、DNA、載體或者組合物的應(yīng)用。
[0031] 具體技術(shù)方案如下。
[0032] 上述寡聚核酸、DNA、載體或者組合物在制備抑制細(xì)胞中⑶44基因表達(dá)制品中的 應(yīng)用。
[0033] 上述寡聚核酸、DNA、載體或者組合物在制備調(diào)節(jié)細(xì)胞中⑶44基因制品中的應(yīng)用。
[0034] 上述寡聚核酸、DNA、載體或者組合物在制備診斷⑶44基因異常引發(fā)的疾?、?4 的試劑中的應(yīng)用。
[0035] 上述寡聚核酸、DNA、載體或者組合物制備治療CD44基因異常引發(fā)的疾病的藥物 中的應(yīng)用。
[0036] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述CD44基因異常引發(fā)的疾病可選自炎癥、癌癥。
[0037] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述CD44基因異常引發(fā)的疾病為關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或 滑膜炎。
[0038] 本發(fā)明針對(duì)CD44基因 CDs區(qū)域內(nèi)的不同位置進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，選擇了 9對(duì)針對(duì)人與 鼠同源基因的siRNA進(jìn)行篩選試驗(yàn)。研究結(jié)果表明：與陰性對(duì)照SiRNA相比，反義鏈含有核 苷酸序列為"5' AUUUCCUGAGACUUGCUGG3' "的siRNA-CD-06對(duì)CD44基因 mRNA表達(dá)抑制效果 最強(qiáng)，對(duì)⑶44基因的mRNA沉默效率達(dá)87 % (實(shí)施例二）。在免疫印跡（western blotting) 實(shí)驗(yàn)中，與空白和陰性對(duì)照組相比加入siRNA-⑶-06后，⑶44蛋白表達(dá)水平明顯下降，差異 有顯著性（P〈〇. 05)(實(shí)施例三）。經(jīng)IL l-α刺激后的細(xì)胞中加入siRNA-⑶-06,與加入陰 性對(duì)照寡聚核酸相比，細(xì)胞炎癥因子TNF、COX-2、IL-I β含量明顯下降，表明siRNA-⑶-06 具有消除炎癥效果（實(shí)施例四）。在實(shí)施例五中，本發(fā)明對(duì)序列進(jìn)行了優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明： 反義鏈含"5' AUUUCCUGAGACUUGCUGG3'的同源序列的雙鏈寡核酸對(duì)CD44基因 mRNA具有抑 制效果；正義鏈與反義鏈反向完全互補(bǔ)或部分僅部分互補(bǔ)對(duì)CD44基因 mRNA也具有抑制效 果，且含有與反義鏈70%同源序列的雙鏈RNA也具有抑制效果。實(shí)施例六應(yīng)用質(zhì)粒載體表 達(dá)"5' AUUUCCUGAGACUUGCUGG3' "序列，在細(xì)胞中也具有良好的CD44基因的mRNA抑制效果。 實(shí)施例七研究了化學(xué)修飾對(duì)核酸沉默CD44基因效果的影響，結(jié)果表明：經(jīng)適當(dāng)?shù)男揎椇蟮?寡聚核酸對(duì)CD44基因具有良好的抑制作用。實(shí)施例八的研究表明，經(jīng)化學(xué)修飾后，本發(fā)明 的siRNA在血清中的穩(wěn)定性顯著提高。實(shí)施例九和實(shí)施例十為siRNA的活體大鼠試驗(yàn)，在 關(guān)節(jié)炎模型大鼠的關(guān)節(jié)腔內(nèi)單獨(dú)或混合注射含反義鏈" 5' AUUUCCUGAGACUUGCUGG3' "的化學(xué) 修飾物，后續(xù)的組織病理切片和關(guān)節(jié)液炎癥因子含量檢測(cè)試驗(yàn)表明，寡聚核酸在大鼠體內(nèi) 有明顯的炎癥抑制作用。
[0039] 本發(fā)明的創(chuàng)新性主要體現(xiàn)在：1、本發(fā)明運(yùn)用基因沉默技術(shù)，經(jīng)過(guò)大量的設(shè)計(jì)、篩 選、分析與驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)了一類對(duì)CD44有顯著抑制作用的寡聚核酸，在一類hFLS細(xì)胞中，抑制 效率達(dá)到88%，且與該序列具有70%以上同源性的核酸序列都能起到基因沉默的效果，表 明本發(fā)明是一類對(duì)C