先天性白內(nèi)障pitx3基因新突變的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及疾病相關(guān)突變基因領(lǐng)域，特別是遺傳疾病基因突變，先天性白內(nèi)障相 關(guān)基因突變。
【背景技術(shù)】
[0002] 任何因素引起的晶狀體混濁使其透明性下降都可以稱(chēng)為白內(nèi)障（cataract)，估 計(jì)全球約25 %的人患有白內(nèi)障，大多數(shù)人晶狀體混濁較少，沒(méi)有明顯地影響視力。但白內(nèi)障 仍是全球第一位致盲的眼病，每年新增加的白內(nèi)障盲人或視殘患者有125萬(wàn)人。白內(nèi)障根 據(jù)發(fā)病年齡分為先天性白內(nèi)障（congenital cataract, CC)和老年性白內(nèi)障（age-related cataract)。先天性白內(nèi)障是指出生前即存在、或出生后逐漸形成的在出生后一年內(nèi)發(fā)生的 晶體部分或全部混濁。雖然先天性白內(nèi)障不如老年性白內(nèi)障常見(jiàn)，可它卻是兒童常見(jiàn)的眼 病，在我國(guó)新生兒中患病率為0.01%-0.06%，占兒童致盲眼病的第2位。先天性白內(nèi)障 由于在胚胎期晶狀體代謝異常而導(dǎo)致其自身透明度下降，任何參與、影響晶狀體發(fā)育的基 因突變都可能導(dǎo)致先天性白內(nèi)障的發(fā)生。
[0003] 先天性白內(nèi)障既可獨(dú)立發(fā)病，也可作為眼部或全身其它系統(tǒng)先天性病變綜合征的 一部分，發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，其中約1/3為遺傳性因素。絕大多數(shù)先天性白內(nèi)障是單基因 遺傳病，其遺傳方式包括常染色體顯性遺傳 （autosomal dominant congenital cataract， ADCC)，常染色體隱性遺傳 （autosomal recessive congenital cataract，ARCC)和 X 連鎖 遺傳（X-linked congenital cataract，XLCC)三種。其中以ADCC最為常見(jiàn)，夕卜顯率高，研 宄相對(duì)集中。此外，少數(shù)先天性白內(nèi)障可能與染色體結(jié)構(gòu)異常或線粒體病有關(guān)。
[0004] 隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展，迄今為止已報(bào)道了 26個(gè)基因及超過(guò)40個(gè)基因位點(diǎn)與先 天性白內(nèi)障發(fā)病相關(guān)。包括晶狀體蛋白（CRYAA，CRYAB，CRYBA1/A3, CRYBBl，CRYBB2, CRYGC， CRYGD)、縫隙連接蛋白（GJA8，GJA3)、主要內(nèi)源性蛋白（MIP)、細(xì)胞骨架蛋白（BFSP2)和轉(zhuǎn)錄 因子（PITX3, HSF4 和 MAF)等。
[0005] 先天性白內(nèi)障因晶狀體混濁的部位、形態(tài)和程度不同，形態(tài)學(xué)表現(xiàn)各異。常見(jiàn)的有 繞核性白內(nèi)障（perinuclear cataract)又稱(chēng)板層白內(nèi)障（lamellar cataract)、核性白內(nèi) 障（nuclear cataract)、前極白內(nèi)障（anterior pole cataract)、后極白內(nèi)障（posterior polecataract)、粉塵狀白內(nèi)障（pulverulent cataract)、點(diǎn)狀白內(nèi)障（punctate cataract)、膜性白內(nèi)障（membrane cataract)、盤(pán)狀白內(nèi)障（disciform cataract、Coppock cataract)、縫狀白內(nèi)障（sutural catatract)、珊瑚狀白內(nèi)障（coralline cataract)、花 冠狀白內(nèi)障（coronal cataract)以及全白內(nèi)障（total cataract)等表型。資料顯示先天 性白內(nèi)障具有高度的遺傳異質(zhì)性：表型相同的先天性白內(nèi)障可能是由不同基因突變或相同 基因的不同突變?cè)斐傻?，而同一基因的相同或不同突變可有不同的臨床表現(xiàn)，可能與其它 修飾基因或環(huán)境因素有關(guān)。先天性白內(nèi)障表型和基因型的關(guān)系，至今仍不明確。還有許多 定位后未發(fā)現(xiàn)致病基因和許多候選基因沒(méi)有在人類(lèi)得到證實(shí)。
[0006] 由于先天性白內(nèi)障在早期即可以發(fā)生剝奪性弱視，因此其治療又不同于一般成人 白內(nèi)障。目前對(duì)該病的治療以手術(shù)為主，雖然手術(shù)的方式和技巧在不斷的改進(jìn)，但由于兒童 的眼睛結(jié)構(gòu)解剖特點(diǎn)和對(duì)手術(shù)的反應(yīng)情況與成人有很大差別，手術(shù)并發(fā)癥和后遺癥的機(jī)率 要高得多。例如：后發(fā)性白內(nèi)障，晶體瞳孔夾持，繼發(fā)性青光眼等，且術(shù)后不可逆性弱視、無(wú) 晶體眼高度遠(yuǎn)視的屈光狀態(tài)和人工晶體眼無(wú)調(diào)節(jié)的屈光狀態(tài)都對(duì)患者有很大的影響，而且 手術(shù)治療，費(fèi)用昂貴。因此先天性白內(nèi)障的治療仍是眼科的難題。通過(guò)先天性白內(nèi)障致病 機(jī)制的研宄，尋找基因突變中的致病機(jī)理，探索一種簡(jiǎn)捷有效的藥物治療途徑，攻克人類(lèi)第 一大眼病，對(duì)人類(lèi)意義重大。
[0007] 全外顯子組測(cè)序是利用特制的DNA序列探針將全基因組中的外顯子區(qū)域捕獲下 來(lái)，然后針對(duì)每個(gè)外顯子進(jìn)行深度測(cè)序的技術(shù)，與傳統(tǒng)的連鎖分析、候選基因關(guān)聯(lián)分析技術(shù) 相比，外顯子組測(cè)序技術(shù)針對(duì)基因組內(nèi)編碼蛋白質(zhì)的外顯子區(qū)域，目標(biāo)集中，測(cè)序深度和精 度更高。2009年，美國(guó)Sarah B Ng等人利用外顯子組測(cè)序成功定位出mile綜合癥的基因 DHODH。我國(guó)Wang等人利用外顯子組測(cè)序發(fā)現(xiàn)了小腦共濟(jì)失調(diào)的新的突變基因 TGM6。近 期，隨著外顯子組測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，一批新的致病突變基因被相繼發(fā)現(xiàn)，極大地推動(dòng)了 相關(guān)疾病及治療措施的研宄進(jìn)展。
[0008] 確定新的先天性白內(nèi)障相關(guān)基因的致病突變，對(duì)開(kāi)展先天性白內(nèi)障的分子診斷具 有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明采用新一代的全外顯子組測(cè)序技術(shù)，針對(duì)一個(gè)中國(guó)漢族常染色體顯性遺傳 的先天性白內(nèi)障患病家系進(jìn)行了全部外顯子區(qū)域的高通量測(cè)序，結(jié)合生物信息分析發(fā)現(xiàn) PITX3基因上的c.608delC(p.A203fS)突變與先天性白內(nèi)障（CC)有關(guān)，并通過(guò)共分離實(shí)驗(yàn) 等方法驗(yàn)證了這一變異，將會(huì)為CC發(fā)病機(jī)制的研宄奠定重要基礎(chǔ)，也有可能為CC患者治療 提供全新的理論依據(jù)，豐富和完善CC疾病的診斷流程，從而對(duì)CC患者的臨床診斷提供更多 的支持和參考，為開(kāi)發(fā)有效的早期致病基因篩查和干預(yù)治療措施提供科學(xué)依據(jù)。
[0010] 因此，本發(fā)明涉及先天性白內(nèi)障基因的突變，具體為：PITX3基因上的c.608delC/ р. A203fs〇
[0011] 在第一方面，本發(fā)明涉及先天性白內(nèi)障的生物標(biāo)記物，即PITX3的突變，所述生物 標(biāo)記物是具有如下的突變PITX3基因或蛋白：c. 608delC/p. A203fs。
[0012] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的突變PITX3基因?yàn)榫哂幸韵峦蛔兊腟EQ ID NO:3 : с. 608delC，突變的PITX3基因的cDNA編碼區(qū)序列為SEQIDN0:3的序列表示。
[0013] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的突變PITX3蛋白為具有以下突變的SEQ ID N0:4: р. A203fs，突變的PITX3蛋白為SEQ ID N0:4的序列表示。
[0014] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及包含突變PITX3基因的構(gòu)建體或重組細(xì)胞，所 述突變是：c. 608delC，例如所述突變PITX3基因?yàn)镾EQ ID NO:3。
[0015] 在第二方面，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)先天性白內(nèi)障的方法，所述方法包括檢測(cè)受試 者的PITX3基因或蛋白中是否存在突變位點(diǎn)，如果有突變位點(diǎn)，則所述受試者被鑒定為 患有先天性白內(nèi)障，或者其后代會(huì)患有先天性白內(nèi)障或易患先天性白內(nèi)障，所述突變?yōu)?с. 608delC/p. A203fs〇
[0016] 在一個(gè)實(shí)施方案中，PITX3基因的cDNA編碼區(qū)序列為SEQ ID NO: 1的序列表示， 突變的PITX3基因的cDNA編碼區(qū)序列為SEQ ID N0:3的序列表示。
[0017] 在一個(gè)實(shí)施方案中，PITX3蛋白為SEQ ID NO:2的序列表示，突變的PITX3蛋白為 SEQ ID NO:4的序列表示。
[0018] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的檢測(cè)先天性白內(nèi)障的方法包括如下引物擴(kuò)增的步 驟：
[0019] SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 ;
[0020] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的檢測(cè)先天性白內(nèi)障的方法中檢測(cè)突變位點(diǎn)通過(guò)選自 如下的技術(shù)進(jìn)行：測(cè)序、電泳、核酸雜交、PCR、逆轉(zhuǎn)錄酶鏈反應(yīng)和變性高效液相色譜，基于熒 光標(biāo)記技術(shù)的DNA測(cè)序。
[0021] 在本發(fā)明第二方面的方法中，優(yōu)選檢測(cè)PITX3基因的突變c. 608delC (即PITX3蛋 白的突變P.A203fs)。
[0022] 在第三方面，本發(fā)明涉及一種突變PITX3基因的篩選系統(tǒng)，所述篩選系統(tǒng)包括檢 測(cè)受試者的PITX3基因（蛋白）中是否存在PITX3基因的突變c.608delC(即蛋白的突變 p. A203fs)〇
[0023] 在一個(gè)實(shí)施方案中，PITX3基因?yàn)镾EQ ID N0:1的序列表示，突變的PITX3基因的 cDNA編碼區(qū)