，但不局限于這些范例。
[0022] 實(shí)施范例1 :
[0023] 我們和國(guó)外農(nóng)業(yè)高校、科研院所合作，以優(yōu)良親本構(gòu)建了瓠瓜的重組自交系群體， 含有165個(gè)單株；以這些單株為試驗(yàn)材料提取DNA，根據(jù)獲得的抗病毒病基因序列設(shè)計(jì)特異 引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)特異DNA片段在群體單株中分離情況，依據(jù)瓠瓜病毒病抗病性鑒 定結(jié)果，獲得與瓠瓜抗病毒病緊密連鎖的DNA片段。
[0024] 實(shí)施范例2 :
[0025] 在種質(zhì)資源創(chuàng)制過(guò)程中，以感病親本和抗病親本雜交獲得的后代個(gè)體為對(duì)象，提 取各自的基因組DNA，根據(jù)實(shí)施范例1獲得的與病毒病基因緊密連鎖的DNA片段設(shè)計(jì)引物， 對(duì)上述獲得的瓠瓜基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凡是擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)DNA特異片段的雜種材料， 抗病毒病雜種植株，或者是抗病毒病基因的攜帶者，這些材料科研進(jìn)一步用于抗病品種培 育的親本和育種種質(zhì)，實(shí)現(xiàn)了分子標(biāo)記輔助選擇。
[0026] 實(shí)施范例3 :
[0027] 我們采用人工接種和田間接種鑒定相結(jié)合的方法，對(duì)上述的重組自交系群體進(jìn)行 接種鑒定，根據(jù)實(shí)施范例1獲得的與病毒病緊密連鎖的DNA片段，設(shè)計(jì)特異引物，對(duì)上述單 株個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增；結(jié)合廣泛的分子標(biāo)記如AFLP、SRAP等，分析這些標(biāo)記在單株群體中的 分離情況，結(jié)合人工接種和田間接種鑒定結(jié)果，利用MAPMARKER軟件進(jìn)行瓠瓜抗病毒病基 因的分子作圖，獲得病毒病抗病區(qū)段的遺傳圖譜，為后續(xù)克隆抗病基因奠定基礎(chǔ)。
[0028] 實(shí)施范例4 :
[0029] 應(yīng)用北京天根公司RNA提取試劑盒提取抗病毒病親本Al葉片總RNA，利用cDNA 合成試劑盒合成cDNA第一鏈；將實(shí)施范例1獲得的瓠瓜抗病毒病基因片段DNA序列，設(shè)計(jì) 特異引物，結(jié)合cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（RACE技術(shù)）試劑盒所帶的引物相結(jié)合，分別進(jìn)行 5' RACE和3' RACE PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物分別在1 %的瓊脂糖凝膠電泳獲得5' RACE和3' RACE 全長(zhǎng)序列。分別回收PCR產(chǎn)物，進(jìn)行T克隆，獲得全長(zhǎng)序列后進(jìn)行基因全長(zhǎng)的連接；從而克 隆了瓠瓜抗病毒病基因全長(zhǎng)，為通過(guò)基因工程改良瓠瓜品種的抗病性提供了基因資源。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 瓠瓜抗病毒病基因片段或者基因標(biāo)記，其特征在于選自下列基因片段或者基因標(biāo)記 之一： I GCGGGTATGG GGAAAACTAC CATTGCAAAA GCACTTTACA ATCAACTTTA TCACAACTTT 61 GAAGCCAAAT GTTTCCTTTC CAATATCAAA CAAACCTCCA ACCAACCCAA TGCCCTAATT 121 CACTTACAAC AACAACTCCT CTCTTCTATC ACAAAATCCA CCAACATCAA TCTCGAAAAC 181 GTCGACCGAG GAATCGCCGT GTTGCAAGAA AGACTTCGTC GCAAAAAGCT TCTTTTGATA 241 TTAGACGACG TAGACGAAAT AAGTCAGTTA AATGCACTAG CAAGAAGTCG TGAATGGTTC 301 GGTACAGGTA GTAGAATTAT CATAACAACT CGAGATCGAC ATTTACTAAA TCAGCTTGAA 361 GTAGACGGAC TTTGTTCCAT TGATGAAATG AATGACGCTG AAGCGCTCGA ACTCTTTAGT 421 TGGCATGCCT TCCGCAATAG TTATCCATCG GAAACTTTTC ATCCACTTTC GAAACTCGTT 481 GTCAATTATT GTCAAGGGTT CCCTCTAGCG I GCAGGCATGG GTAAAACTAC CATTGCAAAA GCACTTTACA ATCAACTTTA TCACAACTTT 61 GAAGCCAAAT GTTTCCTTTC CAATATCAAA CAAACCTCCA ACCGACCCAA TGCCCTAATT 121 CACTTACAAC AACAACTCCT CTCTTCTATC ACAAAATCCA CCAACATCAA TCTCGAAAAC 181 GTCGACCGAG GAATCGCCGT GTTGCAAGAA AGACTTCGTC GCAAAAAGCT TCTTTTGATA 241 TTAGACGACG TAGACGAAAT AAGTCAGTTA AATGCAATAG CAAGAAGTCG TGAATGGTTC 301 GGTTCAGGTA GTAGAATTAT CATAACAACT CGAGATCGAC ATTTACTAAA TCAGCTTGAA 361 GTAGACGGAC TTTGTTCCAT TGATGAAATG AATGACGCTG AAGCGCTCGA ACTCTTTAGT 421 TGGCATGCCT TCCGCAATAG TTATCCATCG GAAACTTTTC ATCCACTTTC GAAACTCGTT 481 GTCGATTATT GTAAAGGGTT TCCTCTAGTA I CCAGGTTCAG GTAAAACTAC GCTAGCACAT GAAATTTTAA AAAGAATCGT GGAGAGTAAG 61 TCATTTGATG AAGTGGTAAT GTCCACGGTC AGCCAAACAC CAGATGTGAA AAATATTCAA 121 GGACAACTAG CTGAAAAGCT GGGTTTGAAA CTCGAAGAAG AAACAATAGA AGGAAGGGCA 181 GTGATGCTAC AAAAGAGGTT GAAGGGGACG AAAAGTATCC TAGTTTTGTT GGATGATGTA 241 TGGGATTATG ATGAGTTGAA AAAAATAGGA CTTCCAAGTG TTAAATATCA CATAGGATGC 301 AAAACCTTGT TTACCTCTAG GGATAGACAT TTGTTCTCAA ATGAAATGTG CATCAATAAA 361 ATCTTTGAGA TAAAAGTTTT AGAAGAAGAT GAGTCGTGGA ATTTATTTGA GGCAACAATG 421 GGAGGTAAAA TAATTGATGA AGCATGTGAT CTGAAGCCTA CAGCTAGTCA AGTAGTAAGA 481 GAATGTCAAG GGCTCCCTCT AGCA。
2. 權(quán)利要求I所述快速鑒定瓠瓜病毒病的應(yīng)用，包括： 1) 攜帶有上述3個(gè)基因的育種材料的創(chuàng)制或者新品種創(chuàng)制：利用權(quán)利1所給出的基因 源為親本材料，在雜交、回交后代中，可以獲得轉(zhuǎn)育有病毒病抗性基因的育種材料。 2) 抗病毒病基礎(chǔ)理論研究：對(duì)權(quán)利1的3個(gè)病毒病基因進(jìn)行分子標(biāo)記分析；對(duì)該基因 進(jìn)行分子作圖或者基因定位；對(duì)該基因進(jìn)行克隆以及基因間互作分析。 3) 抗病毒病轉(zhuǎn)基因研究：利用權(quán)利要求1所給出的3個(gè)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究。
【專利摘要】本發(fā)明主要涉及到瓠瓜抗病毒病基因片段或基因標(biāo)記及應(yīng)用；主要是采用抗病基因同源序列法，快速分離瓠瓜抗病毒病基因片段或基因標(biāo)記3個(gè)，通過(guò)測(cè)序，這些基因片段或基因標(biāo)記的核苷酸長(zhǎng)度分別為510bp、510bp、504bp。該發(fā)明有效的縮短了瓠瓜抗病毒病基因挖掘周期，有利于病毒病基因的快速鑒定；通過(guò)鑒定的病毒病基因開(kāi)發(fā)相應(yīng)的共分離功能性標(biāo)記(SNP、SCAR等)，還可以快速的用于抗病毒病基因的分子標(biāo)記輔助選擇，準(zhǔn)確性高；結(jié)合其它抗病基因分子標(biāo)記可進(jìn)行多抗性育種材料的創(chuàng)制，縮短育種年限，提高育種效率；為闡述瓠瓜抗病毒病基因分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
【IPC分類】C12N15-29, C12Q1-68, C12N15-11
【公開(kāi)號(hào)】CN104561029
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310524812
【發(fā)明人】錢(qián)孝英, 錢(qián)春桃
【申請(qǐng)人】常熟市智林蔬果專業(yè)合作社
【公開(kāi)日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2013年10月28日