含重組嵌合抗原受體基因表達盒的微環(huán)dna重組母質粒、含該表達盒的微環(huán)dna及應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術領域，特別是涉及一種含重組嵌合抗原受體基因表達盒的微 環(huán)DNA重組母質粒及其構建方法和應用，和一種含重組嵌合抗原受體基因表達盒的微環(huán) DNA及其構建方法和應用，一種具有含重組嵌合抗原受體基因表達盒的微環(huán)DNA的宿主細 胞及其應用，以及一種重組嵌合抗原受體及其表達方法和應用。
【背景技術】
[0002] 臨床上，重組嵌合抗原受體已被用來治療各種疾病，包括癌癥和自身免疫性疾病 等。但是目前重組嵌合抗原受體一般是在體外生產后再注射到體內進行治療，這種方式有 多種缺點，比如：（1)生產、包裝、運輸、保存等環(huán)節(jié)花費大、成本高；（2)蛋白抗體藥物純度 不高，污染物存在副作用，有安全隱患；（3)抗體的半衰期短，需反復注射，有時還需要用微 泵給藥法維持體內抗體的有效濃度，加大了抗體臨床應用的難度，且治療費用高昂。
[0003] 基因治療采用基因轉染的方式將治療性基因轉染到人體靶細胞，是避免直接注射 蛋白抗體藥物存在的問題的有效途徑之一。在基因治療中，采用有效的載體高效、安全地將 目的基因轉移至宿主細胞內表達非常重要，基因治療載體有重組腺病毒載體、逆轉錄病毒 載體和質粒載體。其中，病毒載體在體內的轉染率高，但制備病毒載體的費用高昂，且病毒 載體存在插入突變的風險和免疫原性，會帶來誘癌風險并可能引發(fā)患者致命的免疫反應。 傳統的質粒載體比病毒載體安全，但比病毒載體的轉染率低，且外源基因只能瞬時表達，如 要穩(wěn)定持久地表達，載體必須整合到宿主細胞染色體上，而載體的隨機整合會引起插入突 變或導致外源基因的沉默，此外，傳統質粒載體中含有細菌復制序列、抗性基因、未甲基化 的CpG基序和一些可能隱減的表達 /[目號，這些序列在質粒復制時是必需的，但在基因治療 中可能引起嚴重的生物安全性問題。

【發(fā)明內容】

[0004] 鑒于此，本發(fā)明實施例第一方面提供了一種含重組嵌合抗原受體基因表達盒的微 環(huán)DNA重組母質粒，該微環(huán)DNA重組母質粒能在宿主菌內完成微環(huán)DNA的重組過程，消除原 核質粒元件。
[0005] 本發(fā)明實施例第二方面提供了一種含重組嵌合抗原受體基因表達盒的微環(huán)DNA 重組母質粒的構建方法。
[0006] 本發(fā)明實施例第三方面提供了一種含重組嵌合抗原受體基因表達盒的微環(huán)DNA， 該微環(huán)DNA可游離于宿主細胞基因組DNA之外穩(wěn)定持久的表達重組嵌合抗原受體基因。
[0007] 本發(fā)明實施例第四方面提供了一種含重組嵌合抗原受體基因表達盒的微環(huán)DNA 的構建方法。
[0008] 本發(fā)明實施例第五方面提供了一種具有含重組嵌合抗原受體基因表達盒的微環(huán) DNA的宿主細胞。
[0009] 本發(fā)明實施例第六方面提供了一種重組嵌合抗原受體。
[0010] 本發(fā)明實施例第七方面提供了一種重組嵌合抗原受體的表達方法。
[0011] 本發(fā)明實施例第八方面提供了一種含重組嵌合抗原受體基因表達盒的微環(huán)DNA 重組母質粒、含重組嵌合抗原受體基因表達盒的微環(huán)DNA、具有含重組嵌合抗原受體基因表 達盒的微環(huán)DNA的宿主細胞和重組嵌合抗原受體的應用。
[0012] 第一方面，本發(fā)明提供了一種含重組嵌合抗原受體基因表達盒的微環(huán)DNA重組母 質粒，所述微環(huán)DNA重組母質粒是在微環(huán)DNA空質粒的多克隆位點（MCS)中插入重組嵌合抗 原受體基因表達盒的基因序列組合而成，其中，所述微環(huán)DNA空質粒為ρ2 Φ〇31質?；騪MC. BESPX質粒，所述重組嵌合抗原受體基因表達盒包括依次連接的啟動子、重組嵌合抗原受 體基因、終止密碼子和polyA加尾信號。
[0013] 優(yōu)選地，所述重組嵌合抗原受體基因具有編碼重組嵌合抗原受體的核苷酸序列， 所述重組嵌合抗原受體包括胞外抗原識別亞單位、穿膜連接亞單位和胞內信號轉導亞單 位，其中，所述胞外抗原識別亞單位具有腫瘤細胞抗原表位的結合位點和鉸鏈區(qū)，所述穿膜 連接亞單位為胞內信號轉導蛋白的跨膜區(qū)或I型跨膜蛋白的跨膜區(qū)，所述胞內信號轉導亞 單位具有活化免疫效應細胞的胞內信號轉導區(qū)；
[0014] 所述重組嵌合抗原受體的氨基酸序列連接形式依次為：
[0015] 腫瘤細胞抗原表位的結合位點-鉸鏈區(qū)-胞內信號轉導蛋白的跨膜區(qū)或I型跨 膜蛋白的跨膜區(qū)-活化免疫效應細胞的胞內信號轉導區(qū)。
[0016] 其中，所述重組嵌合抗原受體為膜受體分子，其腫瘤細胞抗原表位的結合位點通 過鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)與胞內信號轉導區(qū)依次相連；所述腫瘤細胞抗原表位的結合位點具有結 合腫瘤細胞抗原表位的能力，所述鉸鏈區(qū)能讓該膜受體分子的胞外區(qū)，即腫瘤細胞抗原表 位的結合位點充分伸展，保持其肽段的功能完整性，從而充分行使識別、結合腫瘤抗原的功 能；所述跨膜區(qū)為連接膜受體分子的胞外抗原識別亞單位和胞內信號轉導亞單位的肽段； 所述胞內信號轉導亞單位的肽段具有信號轉導激活基序。
[0017] 進一步優(yōu)選地，所述腫瘤細胞抗原表位的結合位點為單克隆抗體的單鏈可變區(qū) scFv，所述鉸鏈區(qū)為CD8 α鏈的鉸鏈區(qū)，所述I型跨膜蛋白的跨膜區(qū)為CD4、CD28或CD8的 α鏈，所述胞內信號轉導蛋白的跨膜區(qū)為IgG的重鏈，所述活化免疫效應細胞的胞內信號 轉導區(qū)依次包括第二轉導信號和第一轉導信號。
[0018] 更進一步優(yōu)選地，所述單克隆抗體的單鏈可變區(qū)scFv為抗CD19分子單鏈抗體，所 述第一轉導信號為免疫球蛋白Fc ε RI受體的Y鏈和CD3的ζ鏈中的至少一種，所述第二 轉導信號為⑶27、CD28、4-IBB (CD137)、0X40、CD30、CD40、PD-1 和 ICOS 中的兩種。
[0019] ⑶19是B淋巴細胞表面的一種分化抗原，在B淋巴系統惡性腫瘤如急性淋巴細 胞白血病、非何杰金淋巴瘤中廣泛表達。而在造血干細胞、漿細胞、T細胞及其他組織中則 沒有表達，因此CD19是一種理想的腫瘤治療靶點。本發(fā)明采用的單克隆抗體的單鏈可變區(qū) scFv包括抗CD19單克隆抗體輕鏈可變區(qū)及重鏈可變區(qū)，該scFv可以直接識別抗原，不需要 以MHC/抗原肽復合物的形式識別抗原，因此不受MHCI類分子的限制。
[0020] 本發(fā)明采用的胞內信號轉導亞單位包括CD3(鏈的胞內免疫受體激活基序 (ITAM)和共刺激分子⑶28、⑶137 (4-1BB)胞內信號轉導部分，其中，⑶28在促進T細胞產 生IL-2方面優(yōu)于其他分子，⑶137是記憶性T細胞體外擴增的一個重要的共刺激分子。
[0021] 含本發(fā)明提供的重組嵌合抗原受體的T細胞中，含⑶3 ζ -⑶28-⑶137胞內轉導信 號的T細胞，在活化的過程中，CD3(鏈的胞內免疫受體激活基序首先進行磷酸化，然后激 活下游的信號轉導分子如CD28、CD137,從而使T細胞充分活化。
[0022] 特別優(yōu)選地，所述抗⑶19分子單鏈抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示；所述 第二轉導信號依次包括⑶28和4-IBB，所述⑶28的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述 4-IBB的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述第一轉導信號為⑶3的ζ鏈，所述⑶3的 ξ鏈的氨基酸序列如SEQ ID Ν0:4所示。其中，所述抗⑶19分子單鏈抗體的包括抗⑶19 分子的輕鏈和重鏈，所述輕鏈和重鏈之間由連接肽Linker連接，所述Linker的氨基酸序列 為 GSTSGSGKPGSGEGSTKG。
[0023] 更進一步優(yōu)選地，所述⑶8 α鏈的鉸鏈區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 5所示；所述 ⑶8的α鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0024] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的重組嵌合抗原受體(腫瘤細胞抗原表位的結合位點-鉸鏈 區(qū)-胞內信號轉導蛋白的跨膜區(qū)或I型跨膜蛋白的跨膜區(qū)-活化免疫效應細胞的胞內信 號轉導區(qū)）的氨基酸序列為
[0025] SEQ ID N0:1-SEQ ID N0:5-SEQ ID N0:6-SEQ ID N0:2-SEQ ID N0:3-SEQ ID N0:4。
[0026] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的重組嵌合抗原受體(腫瘤細胞抗原表位的結合位點-鉸鏈 區(qū)-胞內信號轉導蛋白的跨膜區(qū)或I型跨膜蛋白的跨膜區(qū)-活化免疫效應細胞的胞內信 號轉導區(qū)）基因的核苷酸序列為
[0027] SEQ ID N0:9-SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:Il-SEQ ID N0:12-SEQ ID N0:13-SEQ ID NO:14。
[0028] 其中，所述核苷酸序列皆為基因 （DNA片段）兩條單鏈之一的核苷酸序列，橫杠 代表各核苷酸序列順序連接。
[0029] 本發(fā)明各核苷酸、氨基酸序列或各多肽之間的橫桿""代表各核苷酸、氨基酸序 列或各多肽之間順序連接，以下同。
[0030] 進一步優(yōu)選地，所述免疫效應細胞選自T淋巴細胞、自然殺傷細胞和巨噬細胞中 的一種。
[0031] 進一步優(yōu)選地，所述腫瘤細胞選自B淋巴細胞腫瘤細胞、白血病細胞、肺癌細胞、 胃癌細胞、結直腸癌細胞、肝癌細胞、食管癌細胞、乳腺癌細胞、胰腺癌細胞、膀胱癌細胞和 甲狀腺癌細胞中的一種。
[0032] 以上所述免疫效應細胞和所述腫瘤細胞為優(yōu)選的種類，實際應用中不限于本發(fā)明 所例舉的具體的上述免疫效應細胞和腫瘤細胞。
[0033] 進一步優(yōu)選地，所述胞外抗原識別亞單位靶向結合所述腫瘤細胞的至少一個抗原 表位。
[0034] 進一步優(yōu)選地，所述啟動子和所述重組嵌合抗原受體基因之間連接有編碼CD8信 號肽的核苷酸序列，所述編碼CD8信號肽的氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示。
[0035] 進一步優(yōu)選地，所述編碼⑶8信號肽的核苷酸序列如SEQ ID NO: 16所示。
[0036] 優(yōu)選地，所述p2 C>C31質粒構建方法參照Chen ZY et al.，Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo, Molecular Therapy, 2003, Volume8, Number3, 495-500、Chen ZY et al. , Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo, Human Gene Therapy, 2005, Volumel6, Numberl, 126-131 和美國專利 US7897380B2。
[0037] 優(yōu)選地，所述pMC. BESPX質粒的全基因序列如Chen ZY et al. , A robust system for production of minicircle DNA vectros, Nature Biotechnology, 2010, Volume28, Nu mberl2, 1289-1291 所述。
[0038] 優(yōu)選地，所述啟動子為巨細胞病毒CMV啟動子、勞斯肉瘤病毒RSV啟動子、泛素 UBC 啟動子和延長因子EFla啟動子。
[0039] 進一步優(yōu)選地，所述啟動子為延伸因子啟動子（EF1 a啟動子)。
[0040] 該EFl a啟動子能使得目的蛋白在NK、T細胞等免疫效應細胞中更高效的表達。
[0041] 優(yōu)選地,所述EFl a啟動子的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示。
[0042] 本發(fā)明采用的啟動子可以為巨細胞病毒CMV、RSV、UBC和EFla等真核表達啟動子 之一，EFl a啟動子只是本發(fā)明構建的微環(huán)DNA母質粒的更優(yōu)選啟動子，本發(fā)明可以根據表 達宿主細胞的不同等條件選擇不同的啟動子構建微環(huán)DNA母質粒。
[0043] 優(yōu)選地，所述終止密碼子的核苷酸序列為TAG。
[0044] 優(yōu)選地，所述polyA加尾信號為牛生長激素多聚核苷酸bpA或SV40加尾信號。
[0045] 進一步優(yōu)選地，所述polyA加尾信號為牛生長激素多聚核苷酸bpA。
[0046] 優(yōu)選地，所述牛生長激素多聚核苷酸bpA加尾信號的核苷酸序列如SEQ ID NO: 15 所示。
[0047] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的重組嵌合抗原受體基因表達盒的完整核苷酸序列為：
[0048] SEQ ID N0:16-SEQ ID N0:8-SEQ ID N0:9-SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:Il-SEQ ID N0:12-SEQ ID N0:13-SEQ ID N0:14-TAG-SEQ ID N0:15。
[0049] 本發(fā)明采用的polyA加尾信號可以為SV40等polyA加尾信號之一，bpA加尾信號 只是本發(fā)明構建的微環(huán)DNA母質粒的更優(yōu)選的加尾信號，本發(fā)明可以根據表達宿主細胞的 不同等條件選擇不同的加尾信號構建微環(huán)DNA母質粒。
[0050] 優(yōu)選地，所述重組嵌合抗原受體基因由全基因合成或PCR克隆的方式獲得。
[0051] 本發(fā)明提供的重組嵌合抗原受體中，穿膜連接亞單位能保證受體蛋白分子表達后 錨定在細胞膜上，且穿膜連接亞單位兩端的胞外抗原識別亞單位和胞內信號轉導亞單位分 別位于細胞膜外、內兩側，從而構成橫穿細胞膜的穿膜蛋白；其中，穿膜蛋白的N端為胞外 抗原識別亞單位，C端為胞內信號轉導亞單位；從功能上來說，本發(fā)明提供的重組嵌合抗原 受體中，其胞外抗原識別亞單位具有結合人腫瘤細胞或病毒感染細胞等細胞表面抗原的功 能域，其胞內信號轉導亞單位能促進效應細胞如T淋巴細胞、NK細胞等的激活，且該激活過 程不受MHC I類分子的限制。此外，T淋巴細胞的傳統激活途徑一般還需要共刺激分子的參 與，因為本發(fā)明提供的重組嵌合抗原受體中帶有的胞內信號轉導亞單位具有第一轉導信號 和第二轉導信號，該兩種信號共刺激分子具有胞內激活基序，能協同使得T細胞分泌的Thl 型細胞因子產生更強、更持久的抗腫瘤效應。
[0052] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的含重組嵌合抗原受體基因表達盒的微環(huán)DNA重組母質粒具 有編碼重組嵌合抗原受體的基因，其中，該重組嵌合抗原受體具有單克隆抗體的單鏈可變 區(qū)scFv為抗CD19scFv抗體，其在激活細胞、產生細胞因子、靶細胞殺傷等方面的作用與雙 鏈TCR相似；連接肽為CD8的鉸鏈區(qū)，該區(qū)富含脯氨酸、絲氨酸和蘇氨酸，不形成α螺旋，易 發(fā)生伸展及一定程度扭曲，有利于抗體的抗原結合部位與抗原表位間的互補性結合；穿膜 連接亞單位為⑶8的α鏈，其負責將scFv連接在細胞膜上；胞內信號轉導亞單位包括第 一轉導信號和第二轉導信號，其中，第一轉導信號為CD3的ζ鏈，第二轉導信號為CD28和 4-ΙΒΒ依次連接的肽段，該第一轉導信號和第二轉導信號可以協同激活T細胞，產生強大的 靶細胞殺傷效應。
[0053] 第二方面，本發(fā)明提供了一種含重組嵌合抗原受體基因表達盒的微環(huán)DNA重組母 質粒的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：
[0054] (1)提供或制備DNA片段，所述DNA片段具有依次連接的重組嵌合抗原受體基因和 終止密碼子；
[0055] (2)將步驟（1)所得的DNA片段插入表達載體的多克隆位點，得到含重組嵌合抗 原受體基因表達盒的重組表達載體，其中，所述表達載體的多克隆位點兩端分別具有啟動 子和po IyA加尾信號；
[0056] (3)將步驟（2)所得的重組表達載體進行雙酶切，得到含重組嵌合抗原受體基因表 達盒的DNA片段，然后將所述含重組嵌合抗原受體基因表達盒的DNA片段插入ρ2Φ031質 粒或pMC. BESPX質粒即得含重組嵌合抗原受體基因表達盒的微環(huán)DNA重組母質粒，其中，所 述重組嵌合抗原受體基因表達盒包括依次連接的啟動子、重組嵌合抗原