促進(jìn)大白菜提前結(jié)球的轉(zhuǎn)錄因子spl9-2及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于作物遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種新的葉球結(jié)球進(jìn)程相關(guān)基 因及其在調(diào)控葉球類植物的結(jié)球進(jìn)程中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)今農(nóng)業(yè)上的蔬菜品種從食用部位來看，可以分為葉類蔬菜，根莖類蔬菜和果實 類蔬菜。其中在葉類蔬菜中，葉球類蔬菜是一個重要的組成部分，其中較為常見的有結(jié)球白 菜（Brassica rapa L. ssp. pekinensis),結(jié)球甘藍(lán)（Brassica oleracea L. var. capitata L)和結(jié)球生菜（Lactuca sativa var.capitata L·)。結(jié)球白菜（又稱大白菜），是亞洲地 區(qū)傳統(tǒng)的蔬菜作物
[0003] 葉球作為該類蔬菜的儲存器官，是其可食用部分，具有重要的農(nóng)業(yè)價值和商品價 值。從形態(tài)上看，葉球是一種變態(tài)器官，由輪生的葉片相互抱合而成，葉子向內(nèi)彎曲是葉球 發(fā)生的顯著特征。
[0004] 已經(jīng)知道，許多因素會影響植物葉球的發(fā)生和發(fā)育過程。生長素在葉片內(nèi)的不均 衡分布、較低的溫度和較大的晝夜溫差、弱光、短日照以及充足的碳素營養(yǎng)都可以促進(jìn)葉球 的發(fā)生和發(fā)育（Ito, 1957)。因此，葉球的發(fā)生是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，是在環(huán)境因子誘導(dǎo) 下的形態(tài)學(xué)反應(yīng)。在此過程中表達(dá)的基因是調(diào)控植物接受外界信號和展開發(fā)育活動的關(guān)鍵 環(huán)節(jié)。
[0005] 以大白菜為例，在栽培條件下，大白菜需要一個長時間的營養(yǎng)生長來形成葉球，通 ?？梢苑譃?個時期：幼苗期，蓮座期，包心期和結(jié)球期，通過葉形態(tài)的特點來劃分。在幼苗 期，幼態(tài)葉生長并分化為成熟葉；在蓮座期，展開的葉片通過提供光合作用產(chǎn)物的方式輔助 葉球形成。包心的葉片分化并向內(nèi)彎曲為葉球形成提供架構(gòu)和遮蔽，而葉球的葉片緊緊地 圍繞莖尖形成儲存營養(yǎng)物質(zhì)的葉球。通常來說，諸如溫度，光照，生長素濃度以及碳氮比都 認(rèn)為和葉球形成有關(guān)（Operfia等，1988 ;He等，2000)。由于葉球是大白菜的主要食用器官， 因此大白菜葉球發(fā)育的好壞決定了大白菜的品質(zhì)和農(nóng)業(yè)價值。我國育種家采用傳統(tǒng)的育種 方法廣泛開展大白菜類蔬菜品種的選育工作，擴(kuò)大資源來源途徑，開展多種品種間的雜交 組合，一定程度提高了白菜類蔬菜葉球性狀，并選育了大量抗蟲抗病，快速生長的品種，在 生產(chǎn)上已經(jīng)發(fā)揮了作用。然而，傳統(tǒng)的育種學(xué)在原有的基礎(chǔ)上進(jìn)行品種的優(yōu)選優(yōu)育，但由于 現(xiàn)有品種的局限性，傳統(tǒng)的配置雜交組合的育種方法受到了一定的限制性，為了適應(yīng)農(nóng)業(yè) 生產(chǎn)的需要，采用新的技術(shù)手段來開發(fā)更為早熟，結(jié)球品種更為多樣化的的大白菜品種變 得日益重要。此外，除了大白菜以外,對結(jié)球甘藍(lán),結(jié)球生菜等其他葉球類蔬菜的葉球農(nóng)業(yè) 性狀的改良，也具有十分重要的意義。
[0006] 植物體基因表達(dá)具有時空特異性，即在不同的時間、空間條件下，有不同的功能基 因表達(dá)，從而調(diào)控不同的生理進(jìn)程。對于葉球類植物而言，其結(jié)球進(jìn)程也是受基因、環(huán)境等 因素影響的。在環(huán)境基本恒定的情況下，結(jié)球進(jìn)程主要受基因的調(diào)控。
[0007] 目前研究發(fā)現(xiàn)，miR156 及其調(diào)控的 SQUAMOSA PROMOTER BINDING-LIKE (SPL)基因 家族調(diào)控擬南芥從幼苗期到成年期的時期轉(zhuǎn)換（Wu等，2009 ;Schwab等，2005)。過量表達(dá) miR156基因能夠延長擬南芥的幼苗期并延遲開花，與此相對的，過量表達(dá)SPL促進(jìn)擬南芥 更早的進(jìn)入成熟期并提早開花（Wang等，2009 ;Wu等，2009)。SPL能夠直接結(jié)合到miR172b 的啟動子上，激活miR172b的表達(dá)，從而抑制APETALA2(AP2)蛋白的活性，促進(jìn)擬南芥開花 (Aukerman 等，2003 ;Wang 等，2009)。
[0008] 相對于擬南芥的營養(yǎng)生長的2個時期，結(jié)球白菜在營養(yǎng)生長階段具有4個時期：幼 苗期，蓮座期，包心期和結(jié)球期。這4個時期構(gòu)成了白菜的一個結(jié)球進(jìn)程。結(jié)球白菜只有完 成了這4個時期，才能發(fā)育出一個完整的葉球。然而，迄今為止，本領(lǐng)域?qū)τ谟绊懓撞私Y(jié)球 進(jìn)程的基因或調(diào)控機(jī)理了解甚少，因此本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)調(diào)節(jié)葉球類植物結(jié)球進(jìn)程的相 關(guān)基因及其應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種可調(diào)節(jié)葉球類植物結(jié)球進(jìn)程的相關(guān)基因及其應(yīng)用。
[0010] 在本方面的第一方面，提供了一種BrpSPL9-2基因或其蛋白在調(diào)控葉球類植物的 結(jié)球進(jìn)程中的應(yīng)用。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述的調(diào)控葉球類植物的結(jié)球進(jìn)程指促進(jìn)結(jié)球。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述的葉球類植物包括葉球類蔬菜，較佳地為結(jié)球白菜、結(jié)球甘 藍(lán)（卷心菜）或結(jié)球生菜。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述的應(yīng)用是用于制備調(diào)控葉球類植物的結(jié)球進(jìn)程的試劑。
[0014] 在本發(fā)明的第二方面，提供了一種調(diào)控葉球類植物的結(jié)球進(jìn)程的方法，所述方法 包括以下步驟：
[0015] (a)將促進(jìn)或拮抗BrpSPL9-2基因或其蛋白的活性或表達(dá)的物質(zhì)給予所述葉球類 植物、植物種子、植物細(xì)胞、組織或器官；和
[0016] (b)培養(yǎng)步驟（a)獲得的植物、植物種子、植物細(xì)胞、組織或器官，從而調(diào)控葉球類 植物的結(jié)球進(jìn)程。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，在步驟（a)中，給予促進(jìn)BrpSPL9_2基因或其蛋白的活性或表達(dá) 的物質(zhì)，從而加速結(jié)球進(jìn)程。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，在步驟（a)中，給予拮抗BrpSPL9_2基因或其蛋白的活性或表達(dá) 的物質(zhì)，從而延緩結(jié)球進(jìn)程。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述的促進(jìn)BrpSPL9-2基因或其蛋白的活性或表達(dá)的物質(zhì)包括 特異性與miR156結(jié)合的反義序列，或表達(dá)所述反義序列的載體。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述的拮抗BrpSPL9_2基因或其蛋白的活性或表達(dá)的物質(zhì)包括 miR156〇
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（a)是將編碼BrpSPL9_2蛋白的多核苷酸轉(zhuǎn)入所述葉 球類植物、植物種子、植物細(xì)胞、組織或器官，獲得轉(zhuǎn)化入編碼BrpSPL9-2蛋白的多核苷酸 的植物、植物種子、植物細(xì)胞、組織或器官。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（a)是將植物、植物種子、植物細(xì)胞、組織或器官與攜 帶含有編碼BrpSPL9-2蛋白的多核苷酸的農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens)接觸，從 而使編碼BrpSPL9-2蛋白的多核苷酸轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并整合到植物細(xì)胞的染色體上。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述的編碼BrpSPL9_2蛋白的多核苷酸具有以下特征：
[0024] (i)所述多核苷酸編碼野生型的BrpSPL9-2蛋白或具有與野生型的BrpSPL9-2相 同功能的突變蛋白；和
[0025] (ii)所述編碼BrpSPL9-2蛋白的多核苷酸中不存在與miR156結(jié)合的結(jié)合區(qū)。 (注：在對應(yīng)的野生型BrpSPL9-2基因中，存在與miR156結(jié)合的結(jié)合區(qū)）
[0026] 在本發(fā)明的第三方面，提供了 BrpSPL9_2基因或其蛋白在篩選葉球類植物的結(jié)球 進(jìn)程促進(jìn)劑或拮抗劑中的應(yīng)用。
[0027] 在本發(fā)明的第四方面，提供了一種篩選葉球類植物的結(jié)球進(jìn)程促進(jìn)劑或拮抗劑的 方法，所述方法包括以下步驟：
[0028] a)將待測物質(zhì)給予某植物；
[0029] b)檢測該植物中BrpSPL9_2基因或其蛋白的活性或表達(dá)情況；
[0030] 如果與未給予待測物質(zhì)的對照植物相比，所述BrpSPL9-2基因或其蛋白的活性或 表達(dá)上調(diào)，則所述待測物質(zhì)是結(jié)球進(jìn)程促進(jìn)劑；
[0031] 如果與未給予待測物質(zhì)的對照植物相比，所述BrpSPL9-2基因或其蛋白的活性或 表達(dá)下調(diào)，則所述待測物質(zhì)是結(jié)球進(jìn)程拮抗劑。
[0032] 在本發(fā)明的第五方面，提供了一種不受miR156調(diào)控的突變型BrpSPL9_2蛋白的編 碼基因，所述的編碼基因具有以下特征：
[0033] ⑴所述突變型編碼基因編碼野生型的BrpSPL9_2蛋白或具有與野生型的 BrpSPL9-2相同功能的突變蛋白；和
[0034] (ii)所述突變型編碼基因的核苷酸中不存在與miR156結(jié)合的結(jié)合區(qū)。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，"不存在與miR156結(jié)合的結(jié)合區(qū)"指缺失野生型BrpSPL9-2的 miR156結(jié)合區(qū)，或者對應(yīng)區(qū)域是與miR156序列不互補(bǔ)，從而不發(fā)生結(jié)合。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，在對應(yīng)于野生型BrpSPL9-2與miR156結(jié)合的結(jié)合區(qū)，所述的編 碼基因的相應(yīng)序列為GCGCCTTAAGCTTGTTAAGC,即SEQ ID NO. :3中第743-762位。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，所述的與miR156結(jié)合的結(jié)合區(qū)所對應(yīng)于的RNA序列為 GCGCCUUAAGCUUGUUAAGC(SEQ ID NO. :21)〇
[0038] 在另一優(yōu)選例中，所述的突變型BrpSPL9-2蛋白的編碼基因的序列如SEQ ID NO. : 3所示。
[0039] 在另一優(yōu)選例中，所述的序列為cDNA序列、mRNA序列、或基因組序列。
[0040] 在另一優(yōu)選例中，所述的基因組序列是如SEQ ID NO. :4所不的序列，并且其 1716-1735位為對應(yīng)于SEQ ID NO. :1中第743-762所示的核苷酸序列（對應(yīng)于SEQ ID NO. : 21所示的RNA序列）。
[0041] 在本發(fā)明的第六方面，提供了一種植物細(xì)胞，所述植物細(xì)胞中含有外源的 BrpSPL9-2蛋白的編碼基因是不受miR156抑制。
[0042] 在另一優(yōu)選例中，所述的編碼BrpSPL9-2蛋白的多核苷酸（即BrpSPL9-2蛋白的 編碼基因）具有以下特征：
[0043] (i)所述多核苷酸編碼野生型的BrpSPL9-2蛋白或具有與野生型的BrpSPL9-2相 同功能的突變蛋白；和
[0044] (ii)所述編碼BrpSPL9_2蛋白的多核苷酸中不存在與miR156結(jié)合的結(jié)合區(qū)。
[0045] 在本發(fā)明的第七方面，提供了一種制備轉(zhuǎn)基因葉球類植物的方法，其特征在于，包 括步驟：從本發(fā)明第六方面所述的植物細(xì)胞再生成植株，所述的植物細(xì)胞為葉球類植物的 細(xì)胞。
[0046] 在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括：對所述轉(zhuǎn)基因的白菜，進(jìn)行葉球結(jié)球進(jìn)程或葉 球形狀測定，并與野生型白菜進(jìn)行比較。
[0047] 在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括：對于選出的葉球進(jìn)程提前的白菜，測量其葉球 形狀發(fā)生變化，從而挑選出改良的白菜品種。
[0048] 在另一優(yōu)選例中，所述的葉球形狀測定包括測量葉球高度、葉球直徑、以及葉球高 度直徑比。
[0049] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0050] 下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的 本發(fā)明范圍。
[0051] 圖1顯示了 miR156、miR156靶基因 SPL基因和miR172在大白菜不同營養(yǎng)生 長時期的表達(dá)。圖I(A)為大白菜不同時期頂端分生組織的小RNA雜交，檢測miR156和 miR172b 的表達(dá)情況；圖 I(B)為大白菜 fee 的 fcpSP13、fcpSPL9-l、fcpSPL9UrpSPL10、 BrpSPL10-2、fcpSPL10-3