生產(chǎn)l-氨基酸的方法
【專利說明】生產(chǎn)L-氨基酸的方法
[0001] 相關(guān)申請
[0002] 本申請要求于2013年10月11日向韓國知識產(chǎn)權(quán)局提交的韓國專利申請?zhí)?10-2013-0121090以及于2014年7月18日向韓國知識產(chǎn)權(quán)局提交的韓國專利申請?zhí)?10-2014-0091307的權(quán)益，以引用的方式將其公開的內(nèi)容整體納入到本文之中。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明的一個或多個【具體實(shí)施方式】涉及利用基因轉(zhuǎn)錄抑制法來生產(chǎn)L-氨基酸的 方法。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 相關(guān)技術(shù)的描述
[0006] 丙酮酸，其是在棒桿菌（coryneform)微生物中對各種碳源進(jìn)行糖酵解而產(chǎn)生的， 經(jīng)由草酰乙酸而轉(zhuǎn)變成天冬氨酸。天冬氨酸可通過不同的生物合成通路轉(zhuǎn)變成多種氨基 酸，如蘇氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸以及賴氨酸等（圖1)。因此，可抑制處于氨基酸生物合成 過程中各個分支點(diǎn)上的基因的表達(dá)，來降低副產(chǎn)物生成并提高目的氨基酸生產(chǎn)。
[0007] 如上所述，為了利用基因工程和代謝工程開發(fā)能夠高效生產(chǎn)目的材料的微生物菌 株，需要選擇性地控制與微生物各種代謝途徑相關(guān)的基因的表達(dá)。最近，報道了一種用于 減弱基因表達(dá)的技術(shù)，稱之為"人工會聚轉(zhuǎn)錄"（artificial convergent transcription) (Krylov 等，J Mol Microbiol Biotechnol，18 :1_13, 2010)。人工會聚轉(zhuǎn)錄是一種用于減 弱目的基因表達(dá)的技術(shù)，通過將啟動子插入到目的基因的轉(zhuǎn)錄終止子的下游區(qū)域中，使得 啟動子的相對方向（opposite direction)引起轉(zhuǎn)錄過程中源自每個啟動子的RNA聚合酶 復(fù)合體的碰撞。
[0008] 本發(fā)明人開發(fā)了一種在乙酸鹽存在的情況下選擇性抑制目的基因表達(dá)的技術(shù)，通 過在目的基因轉(zhuǎn)錄相對的方向上插入乙酸鹽誘導(dǎo)型啟動子進(jìn)行，并有效地應(yīng)用該技術(shù)來抑 制棒桿菌微生物中位于分支點(diǎn)的基因的表達(dá)。隨后發(fā)明人證實(shí)通過利用該技術(shù)提供了以高 產(chǎn)量（yield)生產(chǎn)L-氨基酸的棒桿菌微生物并完成了本發(fā)明。
[0009] 發(fā)明概述
[0010] 本發(fā)明的目的在于提供一種通過利用乙酸鹽誘導(dǎo)型啟動子抑制目的基因轉(zhuǎn)錄來 生產(chǎn)L-氨基酸的方法。
[0011] 本發(fā)明的一個【具體實(shí)施方式】提供了生產(chǎn)L-氨基酸的方法，該方法包括：
[0012] 1)培養(yǎng)能夠生產(chǎn)L-氨基酸的重組棒桿菌微生物，其中該重組棒桿菌微生物通過 將乙酸鹽誘導(dǎo)型啟動子插入到染色體中目的基因的終止密碼子的下游轉(zhuǎn)化的；以及
[0013] 2)在培養(yǎng)過程中加入乙酸鹽以減弱目的基因的表達(dá)并增強(qiáng)重組棒桿菌微生物的 L-氨基酸生產(chǎn)能力。
[0014] 附圖簡述
[0015] 根據(jù)結(jié)合附圖進(jìn)行的實(shí)施方式的以下描述，這些和/或其它方面將變得顯而易見 的以及更容易理解，其中：
[0016] 圖1顯示了棒桿菌微生物中的氨基酸生物合成過程的分支點(diǎn)；以及
[0017] 圖2為示意圖，顯示了通過將aceA基因啟動子a)插入到aceE基因的終止密碼子 和轉(zhuǎn)錄終止子上游之間或b)以與aceE基因轉(zhuǎn)錄方向相反的方向插入至轉(zhuǎn)錄終止子下游而 使得aceE基因表達(dá)受抑制。
[0018] 發(fā)明詳述
[0019] 現(xiàn)在詳細(xì)參考實(shí)施方式，其實(shí)例在附圖中例示，其中相同的參考編號在全文中代 表相同的要素。在這個方面，本發(fā)明【具體實(shí)施方式】可具有不同的形式，并且不應(yīng)當(dāng)被解釋為 限于本文所述的說明書。因此，下文中僅參照附圖描述【具體實(shí)施方式】以解釋本發(fā)明的方面。 "至少一個/種"等表述，當(dāng)在一系列要素之前時，修飾了整個系列的要素，而并不是修飾該 系列的單個要素。
[0020] 在下文中，詳細(xì)描述了本發(fā)明。
[0021] 本發(fā)明的一個【具體實(shí)施方式】提供了生產(chǎn)L-氨基酸的方法，該方法包括：
[0022] 1)培養(yǎng)能夠生產(chǎn)L-氨基酸的重組棒桿菌微生物，其中該重組棒桿菌微生物是通 過將乙酸鹽誘導(dǎo)型啟動子插入到染色體中的目的基因終止密碼子的下游而被轉(zhuǎn)化的；以及
[0023] 2)在培養(yǎng)過程中加入乙酸鹽以減弱目的基因的表達(dá)并增強(qiáng)重組棒桿菌微生物的 L-氨基酸生產(chǎn)能力。
[0024] 本文中所使用的術(shù)語"乙酸鹽誘導(dǎo)型啟動子"是指在乙酸鹽存在的情況下具有基 因表達(dá)誘導(dǎo)活性的啟動子。
[0025] 在棒桿菌微生物中，乙酸鹽被乙酸激酶（acetate kinase) (ackA，NCgl2656)和磷 酸轉(zhuǎn)乙酰酶（phosphotransacetylase) (pta，NCgl2657)，或者被瑭泊酰-CoA :乙酸 CoA-轉(zhuǎn) 移酶（actA，NCgl2480)轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A，隨后在乙醛酸（glyoxalate)循環(huán)中被異梓 樣酸裂合酶（isocitrate lyase) (aceA，Ncgl2248)所代謝。在大腸桿菌（Escherichia coli)中，乙酸鹽被乙酰輔酶A合成酶（acs，b4069)轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A(Gerstmeir等，J Biotechnol，104 :99-122, 2003)。參與乙酸鹽代謝的所述基因的表達(dá)在乙酸鹽存在的情況 下被誘導(dǎo)。因此，當(dāng)使用所述基因的啟動子時，可在乙酸鹽存在的情況下特異性地誘導(dǎo)基因 的表達(dá)。
[0026] 乙酸鹽誘導(dǎo)型啟動子包括異梓檬酸裂合酶（aceA，Ncgl2248)編碼基因的啟動子 或磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶（pta，NCgl2657)編碼基因和乙酸激酶（ackA，NCgl2656)編碼基因的操 縱子的啟動子，其是Pta基因的上游啟動子。更具體地，在上述的乙酸鹽誘導(dǎo)型啟動子中， aceA基因的啟動子如SEQ ID NO: 1的核苷酸序列所示，包括aceA基因上游的486個堿基 對以及來自于開放閱讀框（ORF)N端的36個堿基對。
[0027] pta基因的上游啟動子，其為另一種乙酸鹽誘導(dǎo)型啟動子，如SEQ ID NO :2的核苷 酸序列所示，包括Pta基因上游的340個堿基對。
[0028] 此外，很明顯，能夠通過乙酸鹽誘導(dǎo)目的基因表達(dá)的任何啟動子都可包括在本發(fā) 明的范圍內(nèi)。例如，乙酸鹽誘導(dǎo)型啟動子可包括：包括SEQ ID NO :1或2核苷酸序列，或包 括SEQ IDNO :1或2核苷酸序列的保守序列并在一個或多個位置上進(jìn)行替換、缺失、插入、添 加或倒置（inverse)的一個或多個核苷酸（具體地為2至20,更具體地，2至10,更為具體 地，2至5個核苷酸，取決于蛋白質(zhì)氨基酸殘基的空間構(gòu)象）的核苷酸序列。只要誘導(dǎo)型啟 動子的功能得到維持或增強(qiáng)，可包括核苷酸序列與SEQ ID NO :1或2的核苷酸序列具有超 過80 %同源性，具體地超過90 %，更具體地超過95 %，更更具體地超過97 %。只要誘導(dǎo)型 啟動子的功能得到維持，替換、缺失、插入、添加或倒置的核苷酸序列可包括自發(fā)的突變體 序列，或者甚至是人工突變體序列。
[0029] 本文中所使用的術(shù)語"同源性"是指兩條不同核苷酸序列之間的同一性。同源性 可由本領(lǐng)域已知的方法利用計(jì)算參數(shù)，諸如得分、同一性和相似性的BLAST 2. 0軟件程序 進(jìn)行測定。然而，測定同源性的方法并不限于此。
[0030] 除非在本文中另有說明，術(shù)語"上游"是指5'方向，術(shù)語"下游"是指3'方向。通 常，轉(zhuǎn)錄進(jìn)行的方向是5'至3'，因此啟動子的位置往往位于目的基因的上游（5'）。
[0031] 在本文中，染色體中的目的基因可以是參與從各種碳源中生物合成氨基酸，例如 蘇氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸以及賴氨酸等的過程的基因，特別是位于生物合成通路的分支 點(diǎn)上的基因。
[0032] 例如，對于賴氨酸，參與丙酮酸向乙酰輔酶A的轉(zhuǎn)化的丙酮酸脫氫酶亞基 El (pyruvate dehydrogenase subunit El) (aceE，NCgl2167)基因，從天冬氨酸產(chǎn)生高絲氨 酸的高絲氨酸脫氫酶（homoserine dehydrogenase) (hom，NCglll36)基因，以及利用內(nèi)消 旋-2,6-