磁性輔助的快速適配體選擇方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種選擇方法。具體地說，本發(fā)明涉及一種磁性輔助的快速適配體選 擇方法。
【背景技術】
[0002] 指數(shù)式濃縮的配體系統(tǒng)進化法（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,簡稱SELEX)是一種用于從隨機序列的大型組合庫（原始庫）分 離DNA/RNA序列的體外選擇方法，并且所分離的序列基于DNA/RNA折疊成與分子競爭的三 維形狀的能力結(jié)合于分子。成功的SELEX產(chǎn)品被稱作'適配體（aptamer)'，它的結(jié)構由結(jié) 合袋組成，這些結(jié)合袋可以憑高特異性和親和力結(jié)合于多種分子標靶，從微小分子（例如 有機分子、離子、肽、蛋白質(zhì)、核酸）、大分子到甚至整個細胞、病毒、寄生蟲或組織。一旦針對 分子標靶識別了適配體的序列，那么整個適配體可以通過化學合成來產(chǎn)生。此外，經(jīng)官能團 修飾的適配體可以增加其在各種生物應用中的穩(wěn)定性，如對核酸是有害的環(huán)境。與傳統(tǒng)的 抗體產(chǎn)品相比較，適配體的一個優(yōu)點在于不需要融合瘤和動物犧牲。適配體不僅具有成為 一種出色的靶向病原性和惡性細胞或組織并且取代抗體的工具的潛能，而且還可以應用在 純化、診斷學、生物傳感器以及抗感染劑上。然而，不同于抗體可以購得，對于進一步的應用 適用的適配體較難以獲得。
[0003] SELEX包括多輪交替的培育、分離、洗脫、擴增以及純化步驟，這些步驟可以概括 為：（1)將原始DNA庫與標靶分子混合；（2)將結(jié)合于標靶分子的DNA與未結(jié)合的DNA分離；
[3] 將結(jié)合的DNA從標靶分子洗脫；(4)洗脫的DNA通過PCR擴增以產(chǎn)生一種適配體濃縮的 DNA庫；以及（5)從所述PCR產(chǎn)物純化出單鏈寡核苷酸。從在前一輪中獲得的濃縮的序列庫 開始，重復此程序若干輪。通常，執(zhí)行至少五輪到十五輪SELEX選擇，直到不再可檢測到功 能性核酸物質(zhì)濃縮為止。需要多輪的選擇以分離出具有足夠特異性和結(jié)合親和力（例如納 摩爾解離常數(shù)，Kd)的適配體。一般說來，SELEX是一種耗時又冗長的方法。即使對于其中 適配體的選擇可以在數(shù)天內(nèi)完成的自動化SELEX程序來說，它仍然需要大量制劑和高操作 成本。另外，提出了若干功能性策略來簡化此冗長的程序，包含毛細管電泳（CE-SELEX)和 微流體SELEX(M-SELEX)。然而，CE-SELEX篩選結(jié)合小分子的適配體不太有效，而M-SELEX 需要昂貴的微流體儀器。
[0004] 因為適配體在許多方面有潛力，所以希望發(fā)展一種有效的篩選方法，它足夠簡單 地來快速篩選出適合應用的具有高親和力和特異性的適配體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種磁性輔助的快速適配體選擇方法，它利用生物功能化的磁 性粒子從DNA庫篩選能與標靶結(jié)合的寡核苷酸。所述磁性輔助的快速適配體選擇 (Magnetic-assisted rapid aptamer selection，簡稱MARAS)方法是一種有效獲得高親和 力適配體的方法。此外，把其它適配體選擇方法也需要的材料制備和事后分析排除在外，所 述適配體選擇方法可以在一小時內(nèi)完成，并且可以自動化使之具高產(chǎn)能。
[0006] 本發(fā)明提供一種適配體選擇方法。首先，提供樣品，所述樣品包括至少一個具有多 個寡核苷酸序列的隨機序列庫以及上面接合有標靶分子的多個磁性納米粒子或微米粒子。 所述多個寡核苷酸序列的一部分結(jié)合于上面接合有標靶分子的多個磁性納米粒子或微米 粒子。通過施加振蕩磁場到所述樣品執(zhí)行磁性輔助的篩選以分離結(jié)合于上面接合有標靶分 子的多個磁性納米粒子或微米粒子的所述多個寡核苷酸序列的部分。接著對所分離的結(jié)合 于上面未接合標靶分子的多個磁性納米粒子或微米粒子的所述多個寡核苷酸序列的部分 執(zhí)行陰性選擇。接著通過使用磁性臺架執(zhí)行磁性分離以分離對標靶分子具有特異性的適配 體。
[0007] 本發(fā)明還提供一種適配體選擇方法。首先，提供樣品，所述樣品包括至少一個具有 多個寡核苷酸序列的隨機序列庫以及上面接合有標靶分子的多個磁性納米粒子或微米粒 子。所述標靶分子通過附接到所述多個磁性納米粒子或微米粒子的第一組分和附接到所述 標靶分子的第二組分來接合到所述多個磁性納米粒子或微米粒子。通過施加振蕩磁場來執(zhí) 行磁性輔助的篩選以提供競爭機制。使用上面連接有第一組分的多個磁性納米粒子或微米 粒子，對樣品執(zhí)行陰性選擇，以分離未結(jié)合于上面連接有第一組分的所述多個磁性納米粒 子或微米粒子的所述多個寡核苷酸的一部分。然后通過使用磁性臺架執(zhí)行磁性分離，以分 離未結(jié)合于上面連接有第一組分的多個磁性納米粒子或微米粒子的所述多個寡核苷酸序 列的部分，從而選擇對標靶分子具有特異性的適配體。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述振蕩磁場是旋轉(zhuǎn)磁場。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，執(zhí)行磁性輔助的篩選的工藝進一步包括通過施加固定磁場 強度和多種磁場頻率的旋轉(zhuǎn)磁場執(zhí)行多輪磁性輔助的篩選，其中每輪磁性輔助的篩選中所 用的磁場頻率不同于其它輪磁性輔助的篩選的磁場頻率。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，旋轉(zhuǎn)磁場以14高斯施加，磁場頻率在2赫茲到27千赫茲之 間變化。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述振蕩磁場是交變磁場。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，執(zhí)行磁性輔助的篩選的工藝進一步包括通過施加固定磁場 強度和多種磁場頻率的交變磁場執(zhí)行多輪磁性輔助的篩選，其中每輪磁性輔助的篩選中所 用的磁場頻率不同于其它輪磁性輔助的篩選的磁場頻率。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述交變磁場以25高斯施加，磁場頻率在2赫茲到200千 赫茲之間變化。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，執(zhí)行磁性輔助的篩選的工藝進一步包括通過施加固定磁場 頻率和多種磁場強度的交變磁場執(zhí)行多輪磁性輔助的篩選，其中每輪磁性輔助的篩選中所 用的磁場強度不同于其它輪磁性輔助的篩選的磁場強度。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述交變磁場以100千赫茲施加，磁場強度在12. 5高斯到 400高斯之間變化。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述標靶是C-反應蛋白，第一組分是鏈霉抗生物素蛋白 (streptavidin)并且第二組分是生物素（biotin)。
[0017] 為了使本發(fā)明的以上提及和其它特征以及優(yōu)點可理解，下文伴隨附圖詳細描述若 干例示性實施例。
【附圖說明】
[0018] 附圖包含在內(nèi)以提供對本發(fā)明的進一步了解，并且并入并構成本說明書的一部 分。所述圖說明本發(fā)明的實施例，并且連同說明一起，用以解釋本發(fā)明的原理。
[0019] 圖IA是根據(jù)本發(fā)明的一個實施例的旋轉(zhuǎn)磁場磁性輔助的快速適配體選擇 (RO-MARAS)方法的實驗裝置的示意圖；
[0020] 圖IB是根據(jù)本發(fā)明的一個實施例的交變磁場磁性輔助的快速適配體選擇 (AC-MRAS)方法的實驗裝置的示意圖；
[0021] 圖2示意性說明根據(jù)本發(fā)明的一個實施例的RO-MRAS的頻率相關性分析的工藝 流程示意圖；
[0022] 圖3示出在RO-MRAS中所施加的磁場頻率與通過根據(jù)本發(fā)明的一個實施例的 RO-MRAS篩選的所選擇的20N適配體的解離常數(shù)（Kd)的關系示意圖；
[0023] 圖4示出在AC-MRAS中所施加的磁場頻率與通過根據(jù)本發(fā)明的一個實施例的 AC-MRAS篩選的所選擇的20N適配體的解離常數(shù)（Kd)的關系示意圖；
[0024] 圖5示出在AC-MRAS中所用的磁場強度與通過根據(jù)本發(fā)明的一個實施例的 AC-MRAS篩選的所選擇的20N適配體的解離常數(shù)（Kd)的關系示意圖。
【具體實施方式】
[0025] 本發(fā)明涉及一種適配體選擇方法，它使用生物功能化的磁性粒子從DNA庫篩選與 標靶結(jié)合的寡核苷酸。因為C-反應蛋白（CRP)是發(fā)炎、心臟病發(fā)作、中風以及心血管疾病 的一種常見指示物，所以CRP在以下實驗中用作標靶并且用CRP涂布在生物官能化的磁性 粒子上面以達成實驗目的。本文中，CRP涂布的生物功能化的磁性納米粒子（CRP-MNP)和 CRP涂布的生物功能化的磁性微米粒子（CRP-MMP)由磁矩來驅(qū)動，磁矩是通過外加振蕩磁 場產(chǎn)生。本發(fā)明的適配體選擇方法是一種磁性輔助的快速適配體選擇（MRAS)方法。
[0026] 在執(zhí)行MRAS方法前，需要制備材料。材料制備包含制備隨機序列庫、制備標靶以 及將標靶與隨機序列庫一起培育。這些制備步驟將概述于以下部分中。
[0027] 寡核苷酸庫和引物
[0028] 三種類型的隨機化的寡核苷酸序列60N、40N以及20N用作隨機序列庫。所述隨機 化的寡核苷酸序列書寫為：5' -AGCAGCACAGAGGTCAGATG-Xn-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3'，具 有隨機化的（N)聚體中間部分Xn，而η表示在10到100范圍內(nèi)的任何整數(shù)并且Xn意指η 聚體核苷酸的核苷酸序列。舉例來說，隨機化的寡核苷酸序列60Ν、40Ν或20Ν可以是具有 隨機化的X6(l、X 4tl或X2tl中間部分的核酸序列，并且隨機化的X6(l、X4tl或X 2tl中間部分分別表 示隨機化的60聚體序列（60個核苷酸的序列）、隨機化的40聚體序列或隨機化的20聚體 序列。隨機化的寡核苷酸序列以1毫摩爾規(guī)模合成并且進行PAGE純化（從美國紐約州格 蘭德島市的英杰生命技術公司（Invitrogen Life Technologies, Grand Island, NY, USA) 購買）。一組引物，包含 Lab-正向（Lab-F)5'-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3'（SEQ ID N0.1) 和 Lab-反向（Lab-R) 5' -TTCACGGTAGCACGCATAGG-3'（SEQ ID NO. 2)，用以在 PCR 擴增期間 互補結(jié)合序列庫的5'和3'簡并區(qū)域