些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0065] 實(shí)施例1瘧原蟲檢測(cè)的特異性與靈敏性
[0066] -、實(shí)驗(yàn)步驟
[0067] 1.血液樣本的采集
[0068] 取口岸檢測(cè)病人的全血樣本I. 0ml。
[0069] 2.血液樣本的初步鑒定
[0070] 采用膠體金法初步確定該病人是否感染皰原蟲。
[0071] 3.基因組DNA的提取
[0072] 使用血液樣本基因組DNA提取試劑盒（離心柱型，Qiagen公司）提取瘧原蟲DNA。 取50uL全血樣本，按照試劑盒說明書中的提取步驟提取DNA。
[0073] 4. DNA濃度的測(cè)定
[0074] 使用ABI的實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)儀通過實(shí)時(shí)定量PCR的方法定量瘧原蟲DNA濃度。
[0075] 5.靶基因的擴(kuò)增
[0076] 5. 1引物和探針的設(shè)計(jì)
[0077] 針對(duì)瘧原蟲特有基因，設(shè)計(jì)引物，在引物擴(kuò)增區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)能夠區(qū)別其他菌株的特異 性探針。本實(shí)施例針對(duì)惡性瘧、間日瘧、三日瘧原蟲特有基因分別設(shè)計(jì)了特異性引物和探 針，分別是惡性瘧原蟲的mdr、crt、18SrRNA基因的正反引物和探針（SEQ ID N01-9)，間日 瘧原蟲的SSUrRNA、csp、18SrRNA基因的正反引物和探針（SEQ ID N010-18)，三日瘧原蟲的 18SrRNA基因的兩對(duì)正反引物和探針（SEQ ID N019-24)。特異性探針點(diǎn)入芯片上。
[0078] 5. 2反應(yīng)平臺(tái)
[0079] 在威特芯片儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增與雜交反應(yīng)。為防止引物間的互相作用，分兩個(gè)反 應(yīng)室進(jìn)行PCR反應(yīng)，兩個(gè)反應(yīng)室都可以聯(lián)通到雜交室，PCR后的擴(kuò)增液可以通過注射壓力方 式使其流入雜交室進(jìn)行雜交反應(yīng)。
[0080] PCR 反應(yīng)體系為：2X Mater mix 12. 5ul, PrimerD 2. 5ul，PCR Grade H2O 4ul, PCR Control Iulj Sample 5ul.
[0081] 反應(yīng)條件相同：95°C預(yù)變性15min ;95°C變性15s，60°C退火40s，72°C延伸30s，45 個(gè)循環(huán)，72°C延伸lmin。
[0082] 6.雜交反應(yīng)
[0083] 分別注入PCR反應(yīng)室14. 5ul雜交夜，使雜交夜和擴(kuò)增液都進(jìn)入到雜交艙內(nèi)，反應(yīng) 30min。雜交后的芯片用washing buffer 3000rpm 2min沖洗，直接用威特焚光掃描儀檢測(cè)。
[0084] 7.檢測(cè)體系的靈敏度與特異性
[0085] 鏡檢法確定樣本的陽性：
[0086] 體系靈敏度檢測(cè)：將DNA提取液稀釋成10' 10_2、10' 10Λ以每種稀釋液為模板， 通過Real-time PCR的方法，判斷DNA的濃度。根據(jù)DNA濃度將各個(gè)菌的DNA稀釋到大約 10,100,1000C〇py/ul。取各個(gè)梯度DNA作為模板加入到芯片中進(jìn)行檢測(cè)。
[0087] 8.現(xiàn)場(chǎng)樣品特異性檢測(cè)
[0088] 在云南瘧疾疫區(qū)，取經(jīng)過鏡檢確認(rèn)為惡性瘧原蟲的樣本10份，間日瘧樣本10份， 三日瘧樣本10份，瘧原蟲陰性樣本10份，提取DNA，進(jìn)行芯片測(cè)定。
[0089] 二、結(jié)果
[0090] 1.鏡檢結(jié)果顯示陽性結(jié)果，見圖1-3。
[0091] 2.芯片的檢測(cè)能力
[0092] 用口岸檢測(cè)到的三種瘧原蟲陽性樣品進(jìn)行了芯片實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖4-6。
[0093] 圖4-6顯示，通過芯片實(shí)驗(yàn)，在芯片的相應(yīng)位置會(huì)出現(xiàn)明顯的陽性信號(hào)。陽性樣本 位置出現(xiàn)明顯的雜交信號(hào)，陰性樣本不出現(xiàn)雜交信號(hào)。這表明芯片的檢測(cè)性能良好。
[0094] 3.芯片的靈敏性
[0095] 通過real-time PCR的方法確定DNA模板濃度為：
[0096] 不同濃度DNA樣品芯片檢測(cè)表明，三種瘧原蟲芯片檢測(cè)下限分別為：惡性瘧135 copy DNA分子，間日皰78 copy DNA分子，三日皰87 copy DNA分子。結(jié)果見表1-3。
[0097] 表1惡性瘧實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量模板稀釋后芯片檢測(cè)結(jié)果
[0098]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種快速高通量的瘧原蟲檢測(cè)方法，其特征在于：包括如下步驟： (1) 血液樣本進(jìn)行DNA液提??； (2) PCR 擴(kuò)增： a. PCR反應(yīng)體系包括：PCR反應(yīng)緩沖液，待測(cè)樣本基因特異性正、反向引物，PCR Grade H2O, PCR Control, DNA 提取液； b. 將PCR反應(yīng)液加入已含有待測(cè)基因特異性探針的芯片反應(yīng)室內(nèi)，將芯片放入機(jī)器進(jìn) 行擴(kuò)增反應(yīng)；特異性探針是根據(jù)特異性引物擴(kuò)增區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)，能夠區(qū)別其他物種；特異性探 針點(diǎn)入芯片上； (3) 雜交：PCR擴(kuò)增完后，將雜交反應(yīng)液加入芯片，使雜交液和擴(kuò)增液都進(jìn)入到雜交艙 內(nèi)雜交反應(yīng)； (4) 清洗：雜交后的芯片用洗液沖洗，直接用熒光掃描儀檢測(cè)； (5) 結(jié)果判讀； 所述的待測(cè)樣本基因?yàn)閻盒辕?、間日瘧、三日瘧各自特有基因。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速高通量的瘧原蟲檢測(cè)方法，其特征在于：所述的特有基 因分別是惡性瘧的mdr、crt、18SrRNA基因，間日瘧的SSUrRNA、csp、18SrRNA基因，三日瘧的 18SrRNA 基因。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速高通量的瘧原蟲檢測(cè)方法，其特征在于：所述的特異性 正反引物和探針是： 惡性瘧原蟲 mdr基因 Pfl-F:GTGTTGAAAGATGGGTAAAGAGCAGA (SEQ ID NO 1) Pfl-R:CGTACCAATTCCTGAACTCACTTGTTC (SEQ ID NO 2) Probe:GAACAAAAAGAGTACCGCTGAA (SEQ ID NO 3) crt基因 Pf2-F:GGTGGAGGTTCTTGTCTTGGTAAATG (SEQ ID NO 4) Pf2-R:CGGATGTTACAAAACTATAGTTACC (SEQ ID NO 5) Probe ：GTATTATTTATTTAAGTGTATGTGT (SEQ ID NO 6) 18SrRNA 基因 Lm2-F ：ATTGCTTTTGAGAGGTTTTGTTAC (SEQ ID NO 7) Lm2-R ：GCTGTAGTATTCAAACACAATGAAC (SEQ ID NO 8) Probe ：CATAACAGACGGGTAGTCAT (SEQ ID NO 9) 間日瘧原蟲 SSUrRNA 基因 PvI-F:AGTTCGTGAATATGATTTGTC (SEQ ID NO 10) Pvl-R:CTGCGCTTCTGTACTTGGC (SEQ ID NO 11) Probe:GGGGATTGCAATTATACTTCGTGTCG (SEQ ID NO 12) csp基因 Vp2-F:GGTGAGAACCCAGATGACGAGG (SEQ ID NO 13) Vp2-R:TGGACTCCATGCAGTGTAACCTGT (SEQ ID NO 14) Probe ：GGTGATGGAGCAGCTGTACAG (SEQ ID NO 15) 18SrRNA 基因 Lm2-F ：GCAACGCTTCTAGCTTAATCCAC (SEQ ID NO 16) Lm2-R ：CAAGCCGAAGCAAAGAAAGTCC (SEQ ID NO 17) Probe ：ACTTTGTGCGCATTTTGCTA (SEQ ID NO 18) 三日瘧原蟲 18SrRNA 基因 Pml-F:GTTAAGGGAGTGAAGACGATCAGATACCGT (SEQ ID NO 19) Pml-R:GCCCCAGAACCCAAAGACTTTGATTTCTCA (SEQ ID NO 20) Probe:ATGAGTGTTTCTTTTAGATAGC (SEQ ID NO 21) 和 Pm2-F:ATAACATAGTTGTACGTTAAGAATAACCGC (SEQ ID NO 22) Pm2-R:AAAATTCCCATGCATAAAAAATTATACAAA (SEQ ID NO 23) Probe ：GTATAATTTTTTATGCATGGGAAT (SEQ ID NO 24)
4. 根據(jù)權(quán)利要求I所述的快速高通量的瘧原蟲檢測(cè)方法，其特征在于：步驟（I)中所 述的DNA提取可使用血液樣本基因組DNA提取試劑盒提取瘧原蟲DNA ;取50ul全血，按照 試劑盒說明書中的提取步驟提取DNA。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速高通量的瘧原蟲檢測(cè)方法，其特征在于：步驟（2)中 所述的 PCR 反應(yīng)體系為：2X Mater mix 12. 5ul, PrimerD 2. 5ul，PCR Grade H2O 4ul, PCR Controllul, Sample 5ul〇
6. 根據(jù)權(quán)利要求I所述的快速高通量的瘧原蟲檢測(cè)方法，其特征在于：步驟（2)中所 述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件是：95°C預(yù)變性15min ;95°C變性158,60°〇退火4〇8,72°〇延伸 3〇8,45個(gè)循環(huán)，72°0延伸111^11。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速高通量的瘧原蟲檢測(cè)方法，其特征在于：步驟（3)中所 述的雜交反應(yīng)條件是：注入的雜交液為14. 5ul，反應(yīng)時(shí)間為30min。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速高通量的瘧原蟲檢測(cè)方法，其特征在于：步驟（2)所述 的PCR擴(kuò)增與步驟（3)所述的雜交在芯片儀上完成。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速高通量的瘧原蟲檢測(cè)方法，其特征在于：步驟（4)中所 述的清洗條件是：3000rpm，2min。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速高通量的瘧原蟲檢測(cè)方法，其特征在于：芯片系統(tǒng)直接 檢測(cè)血液中提取的DNA，惡性瘧檢測(cè)的靈敏限為135copy DNA分子，間日瘧檢測(cè)的靈敏限為 78copy DNA分子，三日瘧檢測(cè)的靈敏限為87copy DNA分子。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種快速、高通量的瘧原蟲檢測(cè)方法。本發(fā)明的檢測(cè)方法整合了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR和微陣列這兩種強(qiáng)大的分子生物學(xué)技術(shù)，把PCR雜交的探針直接固定在微陣列中的雜交艙中，與PCR反應(yīng)室在同一張芯片上；檢測(cè)方法包括：血液樣本DNA液提取，PCR擴(kuò)增，雜交，清洗，結(jié)果判讀。本發(fā)明能對(duì)惡性瘧、間日瘧、三日瘧原蟲進(jìn)行快速靈敏的檢測(cè)，通過本發(fā)明可大幅度提高進(jìn)出口口岸一線檢驗(yàn)檢疫人員的檢測(cè)效率，既可減少工作量、又可最大限度地解決傳統(tǒng)檢測(cè)方法可能存在的陽性漏檢問題，從而最大限度地防止瘧原蟲疫情的發(fā)生。
【IPC分類】C12Q1-04, C12Q1-68
【公開號(hào)】CN104561268
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410697132
【發(fā)明人】田楨干, 張子龍, 李深偉, 李美
【申請(qǐng)人】中華人民共和國上海出入境檢驗(yàn)檢疫局
【公開日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2014年11月26日