一種檢測阪崎克羅諾桿菌的目的核苷酸序列及檢測試劑盒與檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及食源致病微生物檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測阪崎克羅諾桿菌的目的 核苷酸序列及檢測試劑盒與檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 阪崎克羅諾桿菌（Cronobacter sakazakii)，是一種食源性條件致病菌，隸屬于克 羅諾桿菌屬（Cronobacter spp)。該菌能引起腦膜炎、菌血癥、壞死性小腸結(jié)腸炎等疾病，死 亡率高達50% -80%，存活者也將終身遭受神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的危害。其主要危害人群為免 疫力低下人群，特別是早產(chǎn)兒、出生體重偏低的嬰幼兒。因而國際食品微生物標準委員會將 其定為"嚴重危害特定人群，威脅生命或?qū)е侣詫嵸|(zhì)性后遺癥"的細菌。阪崎克羅諾桿菌 廣泛存在于自然界中，乳制品，水果，蔬菜，雜糧等均曾分離出該菌。此外，阪崎克羅諾桿菌 還存在于食品工廠各種設(shè)備以及家庭中廚房器具上，能夠?qū)е率澄锏亩挝廴?。阪崎克羅 諾桿菌的廣泛存在嚴重地威脅了人類的生命健康，而對于阪崎克羅諾桿菌的快速檢測可以 做到對于其傳播感染的有效控制。
[0003] 克羅諾桿菌2008年被確認為一個新屬，截止2014年為止共有7個種： Cronobacter sakazakii、 Cronobacter dublinensis、 Cronobacter malonaticus、 Cronobacter muytjensii、Cronobacter turicensis、Cronobacter universalis 和 Cronobacter condimentii。目前用于檢測和鑒定克羅諾桿菌的方法主要是基于生理生化 試驗，但是這些方法都存在檢測周期長、操作繁瑣等缺點，因而難以實現(xiàn)對污染樣品的快速 診斷。已有的基于PCR的檢測方法能夠在較短時間里確認結(jié)果，但這些方法多數(shù)集中于檢 測克羅諾桿菌屬，能夠檢測阪崎克羅諾桿菌的則較為較為罕見。因此目前對于阪崎克羅諾 桿菌的檢測方法是缺乏且無法滿足需求的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是為了彌補現(xiàn)有檢測技術(shù)檢測周期長，操作繁瑣，靈敏度不夠等不 足而提供了一種檢測阪崎克羅諾桿菌的目的核苷酸序列及檢測試劑盒與檢測方法。所述試 劑盒檢測時間短，抗干擾能力強，具有較高的特異性而不受屬內(nèi)其他種的影響。
[0005] 技術(shù)方案
[0006] -種檢測阪崎克羅諾桿菌的目的核苷酸序列，該序列包括152bp，序列為GGCAGCA TGTCATTATCGGACGCCAGCGACACGCCGGTGTACGCGACACTGTCGAAGACTTTGGCGTCAGTATTTCCTTCGCCT ATCATCAGCCGGCTTTTCAGCGTGCGAATATCACGGGAGACGTGGCTGTAGACCGAATGCCACTGATG。
[0007] -種阪崎克羅諾桿菌檢測方法，包括以下步驟：
[0008] (1)提取待測樣品的基因組DNA ;
[0009] (2)以步驟⑴提取的基因組DNA為模板，以CS21-L和CS21-R引物對CS21進 行PCR反應(yīng)，其中CS21-L引物序列為5' -GGCAGCATGTCATTATCGG-3'，CS21-R引物序列為 5' -CATCAGTGGCATTCGGTCTA-3' ；
[0010] (3)檢測PCR產(chǎn)物中是否存在大小為權(quán)利要求I所述的152bp的單一擴增產(chǎn)物。
[0011] 所述的阪崎克羅諾桿菌檢測方法，步驟（2)中PCR反應(yīng)的條件為10XPCR buffer， 10-15mM MgCl2,0. 2-0. 3mM (1ΝΤΡ，10-100μΜ 引物 CS21-L，10-100yM 引物 CS21-R，l-10ng/ μ L基因組DNA，0. 5-?υ/μ L Taq DNA聚合酶，其余以雙蒸水補齊；PCR反應(yīng)程序為：①94°C， 5min ;② 94°C，30s ;③ 6(TC -62°C，30s ;④ 72°C，30s-60s ;⑤ 72°C，7-10min ;⑥ 4°C保存；其 中②至④共30-35個循環(huán)。
[0012] 所述的阪崎克羅諾桿菌檢測方法，步驟（2)中PCR反應(yīng)的條件為10XPCR buffer， 15mM MgCl2,0. 2mM dNTP，10 μ M引物CS21-L，10 μ M引物CS21-R，lng/ μ L基因組DNA，IU/ μ L Taq DNA聚合酶，其余以雙蒸水補齊；PCR反應(yīng)程序為：①94°C，5min ;②94°C，30s ;③60°C， 30s ;④72°C，30s ;⑤72°C，10min ;⑥4°C保存；其中②至④共35個循環(huán)。
[0013] 所述的阪崎克羅諾桿菌檢測方法，步驟（3)中檢測PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳 或聚丙烯酰胺凝膠電泳進行。
[0014] 一種阪崎克羅諾桿菌檢測試劑盒，包括：PCR buffer，MgCl2溶液，dNTP，CS21-L引 物：5' -GGCAGCATGTCATTATCGG-3'，CS21-R 引物：5' -CATCAGTGGCATTCGGTCTA-3' 和 Taq DNA 聚合酶；
[0015] 進一步地，所述的阪崎克羅諾桿菌檢測試劑盒，包括：10XPCR buffer，10-15mM MgCl2溶液，0.2-0. 3mM dNTP，10-100 μ M CS21-L 引物：5'-GGCAGCATGTCATTATCGG-3'， 10-100 μ M CS21-R 引物：5' -CATCAGTGGCATTCGGTCTA-3' 和 0· 5-1U/ μ L Taq DNA 聚合酶。
[0016] 所述的阪崎克羅諾桿菌檢測試劑盒，所述試劑盒還包括含有權(quán)利要求1所述的目 的核苷酸序列的阪崎克羅諾桿菌標準菌株的DNA標準品。
[0017] 在本發(fā)明中擴增產(chǎn)物的判定原則為：PCR反應(yīng)之后，通過凝膠電泳檢測，若步驟 (2)所得的PCR反應(yīng)產(chǎn)物在152bp位置有對應(yīng)產(chǎn)物，則判定結(jié)果為陽性，若所得的反應(yīng)產(chǎn)物 在152bp沒有對應(yīng)產(chǎn)物，則結(jié)果判定為陰性。
[0018] 本發(fā)明適用于食品樣品，尤其是嬰幼兒配方奶粉的檢測。
[0019] 有益效果
[0020] 本發(fā)明提供的一種阪崎克羅諾桿菌檢測試劑盒及其檢測方法，具有快速、特異性 好、抗干擾能力強、結(jié)果判定簡單的優(yōu)點，同時靈敏度高，經(jīng)驗證，利用本發(fā)明提供的方法判 定基因組的最低檢測下限為USfgyL'細胞檢測下限為5.5X103CFU mL'本發(fā)明對于我 國食品安全具有著重要意義。
【附圖說明】
[0021] 圖1為實施例1中引物對CS21以阪崎克羅諾桿菌屬內(nèi)六個種為模板進行PCR反 應(yīng)的2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。圖中，M :DS? 2000DNA marker ;N:陰性對照（CldH2O); 泳道1 - 6依次為：阪崎克羅諾桿菌CICC21560,穆汀斯克羅諾桿菌CICC21563,丙二酸鹽 陽性克羅諾桿菌DSM18702,蘇黎世克羅諾桿菌DSM18703,都柏林克羅諾桿菌DSM18705和 Cuniversalis NCTC9529。
[0022] 圖2為實施例1中測定基因組檢測靈敏度和細胞檢測靈敏度的PCR產(chǎn)物2%瓊脂 糖凝膠電泳結(jié)果。圖中，M:DS? 2000DNA marker;N:陰性對照（CldH2O);圖A對應(yīng)于基因組 檢測靈敏度，泳道1-7分別對應(yīng)不同基因組DNA濃度：13. 5ng μ L-1，I. 35ng μ L-1，135pg μ?Λ?3·5ρ8 μ?Λ?·35ρ8 μ?Λ?35?^ μ?Λ?3·5?^ μ?Λ 圖 B 對應(yīng)于細胞的檢測 靈敏度，泳道 1-8 分別對應(yīng)細胞濃度 5. 5 X IO7CFU ml/1，5. 5 X IO6CFU ml/1，5. 5 X IO5CFU mL' 5· 5 X IO4CFU mL' 5· 5 X IO3CFU mL' 5· 5 X IO2CFU mL' 5· 5 X IO1CFU mL' 5· 5 X IO0CFU mL 1
[0023] 圖3為實施例1中測定抗干擾能力的PCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。 圖中，M :DS? 2000DNA marker ;N :陰性對照（CldH2O)。圖中：泳道1-10對應(yīng)大腸桿菌 CMCC23657 的細胞濃度分別為 IO8CFU mL'IO7CFU mL-1，IO6CFU mL-1，IO5CFU mL-1，IO4CFU mL' IO3CFU mL' IO2CFU mL' IO1CFU mL' IO0CFU mL-1，KT1CFU mL'
[0024] 圖4為實施例2中PCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。圖中，M :DS? 2000DNA marker ;圖A :泳道1-7對應(yīng)阪崎克羅諾桿菌起始接種量為5. SXIOiCFU ml/1時的取樣時間： 0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h。泳道8-14對對應(yīng)阪崎克羅諾桿菌起始接種量為5. 5X10°CFU ml/1時的取樣時間：0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h。圖B :泳道1-7對應(yīng)阪崎克羅諾桿菌起始接 種量為5. SXIOiCFU ml/1時的取樣時間：0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h。泳道8-14為對照，其 取樣時間分別為：〇h、2h、4h、6h、8h、10h、12h。
【具體實施方式】
[0025] 下面通過實施例和附圖的方式來說明和解釋本發(fā)明，但本發(fā)明并不只是限制在所 述的實施例范圍。本實例中，所有引物均交付上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，所 使用的DNA標準分子量DS? 2000DNA marker購置廣州東盛生物科技有限公司。
[0026] 實施例1 :對阪崎克羅諾桿菌標準菌株CICC21560的檢測
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