心源性猝死突變基因檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種心源性猝死突變基因檢測試劑 盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 心源性猝死（Sudden Cardiac Death，SO))系指由于各種心臟原因所致的突然死 亡?？砂l(fā)生于原來有或無心臟病的患者中，常無任何危及生命的前期表現(xiàn)，突然意識(shí)喪失， 在急性癥狀出現(xiàn)后1小時(shí)內(nèi)死亡，屬非外傷性自然死亡，特征為出乎意料的迅速死亡。心源 性猝死是一種受環(huán)境因素和遺傳因素等多因素影響的復(fù)雜性疾病，目前，猝死的年輕化趨 勢日益明顯，嚴(yán)重威脅到青壯年人群及老年人群的身體健康和家庭幸福。
[0003] 目前臨床上主要通過心電圖和心臟彩超對(duì)猝死高危人群進(jìn)行診斷，通過提高個(gè)人 健康意識(shí)，對(duì)高危人群結(jié)合一些藥物和植入型心臟復(fù)律除顫器（ICD)的植入來搶救猝死患 者、減少猝死死亡率。但是ICD的治療仍然存在一定的局限性，近期急性心梗除顫器研宄 (Defibrillator in acute myocardial infarction trial，DINAMIT)研宄，心肌梗死嚴(yán)重 者不能植入ICD，另外，ICD價(jià)格昂貴、有痛性治療容易給患者造成心理負(fù)擔(dān)、加之植入技術(shù) 和隨訪流程復(fù)雜以及ICD不能從根本上消除心律失常等原因限制了 ICD在國內(nèi)的推廣應(yīng) 用。因此，目前心源性猝死一旦發(fā)生便無有效的搶救治療方法，于是其預(yù)防顯得尤為重要， 有效的一級(jí)預(yù)防是降低心源性猝死的最佳途徑。即在猝死未發(fā)生時(shí)，提前對(duì)猝死易感性進(jìn) 行評(píng)估和控制，采取針對(duì)危險(xiǎn)因素（病因）的預(yù)防措施，從而達(dá)到使猝死不發(fā)生或遲發(fā)的目 的。
[0004] 隨著臨床醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)工作者發(fā)現(xiàn)了多種因編碼控制細(xì)胞 膜轉(zhuǎn)運(yùn)Na+、K+、Ca 2+離子通道蛋白基因突變導(dǎo)致心肌細(xì)胞膜離子通道異常、心電節(jié)律紊亂， 從而誘發(fā)猝死的情況，中國人的猝死基因與外國人有所不同，發(fā)現(xiàn)在以往的Na+、K+、Ca 2+離 子通道蛋白基因突變基礎(chǔ)上，NOSlAP基因和NUP155基因的兩個(gè)新的突變點(diǎn)是中國人群特 有的，這兩個(gè)突變點(diǎn)已獲國際權(quán)威基因庫的認(rèn)可。這種基因突變可遺傳給后代并使家族成 員患猝死呈現(xiàn)出年輕化趨勢，由于其疾病的隱匿性在某些外界誘發(fā)因素的影響下可發(fā)生猝 死，也可在睡眠中猝死，因此，檢測猝死突變基因?qū)易迤渌蓡T預(yù)防發(fā)生意外猝死和及時(shí) 治療具有重要意義。猝死易感基因檢測可以在人們還未出現(xiàn)任何癥狀的時(shí)候就提前了解自 己是否攜帶猝死突變基因，有助于高危人群在出現(xiàn)癥狀前進(jìn)行診斷和有針對(duì)性的選用相應(yīng) 受體阻滯劑進(jìn)行治療。
[0005] 綜上所述，針對(duì)中國人群，為了實(shí)現(xiàn)心源性猝死的提前預(yù)防和協(xié)助早期治療，本領(lǐng) 域迫切需要建立心源性猝死突變基因檢測體系、開發(fā)檢測試劑盒并建立猝死易感性風(fēng)險(xiǎn)評(píng) 估體系。
[0006] NUP155、SCN5A、CASQ2、RYR2、KCNH2、KCNQl、NOSIAP、ADRB2 基因等與心源性猝死相 關(guān)，下面為上述基因分子生物學(xué)機(jī)理及其與心源性猝死相關(guān)性分析。
[0007] NUP155(nucleoporin 155kDa)為核孔復(fù)合物基因，是一個(gè)編碼核孔復(fù)合物組分的 基因，其主要功能是控制遺傳物質(zhì)mRNA由細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，以便翻譯成為蛋白質(zhì)。 NUP155是一個(gè)處于比較上游位置的調(diào)控基因，能夠?qū)ζ渌芏嗷蚝偷鞍踪|(zhì)的表達(dá)進(jìn)行調(diào) 控。該基因多態(tài)性對(duì)核孔蛋白的定位及核被膜的形成產(chǎn)生負(fù)面作用，影響了維持心房正常 功能關(guān)鍵基因的mRNA從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致基因表達(dá)分子的重調(diào)并且會(huì)延遲心 肌細(xì)胞的有絲分裂，減少心肌細(xì)胞存活導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡和纖維化從而導(dǎo)致房顫的發(fā)生， 進(jìn)而增加了散發(fā)性房顫和心源性猝死的危險(xiǎn)性。
[0008] SCN5A(sodium channel，voltage-gated，type V)為鈉通道 α 基因，編碼鈉通道 α，是人類電壓門控制鈉通道基因家族一員。心臟鈉通道介導(dǎo)心臟中鈉離子內(nèi)流形成心肌 細(xì)胞動(dòng)作電位的快速上升相，對(duì)興奮傳導(dǎo)起重要作用。該基因多態(tài)性對(duì)鈉離子通道蛋白的 數(shù)目及動(dòng)力學(xué)特征產(chǎn)生負(fù)面影響，使鈉離子內(nèi)流受阻，影響了心肌細(xì)胞動(dòng)作電位的形成，易 導(dǎo)致心肌細(xì)胞去極化異常、心律失常，易導(dǎo)致房顫、LQT、BrS等心臟疾病的發(fā)生，增加了猝死 的風(fēng)險(xiǎn)性。
[0009] CASQ2(calsequesttrin gene 2)為儲(chǔ)媽蛋白基因，編碼儲(chǔ)媽蛋白，CASQ2基因位于 心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)終末池腔內(nèi)，參與心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)鈣離子的儲(chǔ)存與釋放。是心肌細(xì)胞的主 要鈣庫，在每次的收縮與舒張的循環(huán)中結(jié)合并釋放大量的鈣離子。該基因多態(tài)性使心肌細(xì) 胞肌漿網(wǎng)儲(chǔ)存和釋放鈣離子的能力降低，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載，引起延遲后除極，運(yùn)動(dòng)或激 動(dòng)后可能誘發(fā)心律失常，易導(dǎo)致暈厥或猝死的發(fā)生。
[0010] RYR2(cdrdiac ryanodine recptor)為心臟蘭尼受體基因，編碼心臟蘭尼受體，是 心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)上的Ca2+釋放受體。主要調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平，維持心肌細(xì)胞正常的生 理功能。該基因多態(tài)性導(dǎo)致RyR2通道功能發(fā)生異常，肌漿網(wǎng)釋放過多Ca 2+，引起延遲后除 極，心電圖上表現(xiàn)為雙向室速。當(dāng)交感神經(jīng)興奮時(shí)，導(dǎo)致通道通透性增加，使Ca2+外流增加， 容易誘發(fā)早期和延遲后除極，從而導(dǎo)致室性快速性心律失常的發(fā)生，增加了心源性猝死的 易感性。
[0011] KCNH2 (human ether-a-g〇-g〇-related gene)為快速激活延遲整流鉀離子通 道基因，編碼快速激活延遲整流（cardiac rapidly activating delayed rectifier K+ current，IKr)鉀離子通道，在心肌細(xì)胞動(dòng)作電位的復(fù)極化過程中發(fā)揮著重要的作用。該基 因多態(tài)性使IKr通道功能增益，即在動(dòng)作電位的各個(gè)時(shí)期通道功能增強(qiáng)，鉀離子外流增加， 復(fù)極加速，動(dòng)作電位時(shí)程縮短，心房和心室肌復(fù)極的離散度增加，從而易發(fā)生折返性心律失 常，增加了心源性猝死的易感性。
[0012] KCNQl(Potassium voltage-gated channel， KQT-like subfamily， member 1)為 緩慢型延遲整流鉀離子流通道的α亞基基因，編碼緩慢型延遲整流鉀離子流通道（Isk)的 α亞基，其與KCNEl基因編碼的β亞單位-mink蛋白共同組成完整的緩慢激活延遲整流鉀 通道（Iks)，參與動(dòng)作電位2相平臺(tái)期的終止和3相復(fù)極過程，是心肌復(fù)極過程中的關(guān)鍵電 流。該基因多態(tài)性導(dǎo)致通道蛋白功能缺陷，復(fù)極延遲，動(dòng)作電位時(shí)程延長，心電圖表現(xiàn)為QT 間期延長、尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動(dòng)過速（torsade de pointes，TdP)或心室顫動(dòng)，增加了心源 性猝死的易感性。
[0013] NOSlAP (nitric oxide synthase ladaptor protein)為一氧化氮合成酶適配蛋 白基因，編碼神經(jīng)型一氧化氮合成酶適配蛋白，它與神經(jīng)型一氧化氮合酶（nNOS)相互作用 通過抑制L型鈣通道來加速心肌細(xì)胞的復(fù)極化。位于心肌肌漿網(wǎng)的除與鉀鈉泵聯(lián)系外，還 可以通過其PDZ結(jié)構(gòu)域與心肌質(zhì)膜鈣泵相聯(lián)系。位于肌質(zhì)網(wǎng)的nNOS與蘭尼受體（RyR2)和 肌質(zhì)網(wǎng)鈣泵（SERCA2a) -起參與細(xì)胞內(nèi)鈣循環(huán)和興奮一收縮的調(diào)控。該基因多態(tài)性可改 變心臟肌肉收縮時(shí)間即QT間期，導(dǎo)致心律失常，增加猝死的易感性。
[0014] ADRB2(0 2adrenergic rec印tor)為腎上腺素受體2基因，編碼腎上腺素受體2， 交感神經(jīng)活動(dòng)異常是猝死發(fā)生的重要機(jī)制，β 2-腎上腺素能受體（I3 2-AR)作為交感神經(jīng) 作用的重要環(huán)節(jié)，調(diào)節(jié)心肌收縮功能。該基因多態(tài)性可影響交感神經(jīng)興奮性，影響心房肌細(xì) 胞興奮性，加快心率，增強(qiáng)心肌收縮力，從而影響了心源性猝死的易感性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明提供了一種心源性猝死突變基因檢測 試劑盒。具體涉及 NUP155、SCN5A、CASQ2、RYR2、KCNH2、KCNQ1、N0S1AP、ADRB2 基因 SNP (單 核苷酸的多態(tài)性）位點(diǎn)多態(tài)性與心源性猝死相關(guān)性的檢測試劑盒。參照心源性猝死突變基 因篩查體系，利用等位基因特異性PCR技術(shù)，綜合檢測與分析受