引物進(jìn)行PCR鑒定，4個(gè)單克隆均為陽(yáng)性（泳道1-8)，第9個(gè)泳道為Marker (DL2000)。 取鑒定為陽(yáng)性的菌液進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明，所得內(nèi)標(biāo)基因 Se γ -tmt和外源基因 GUS序列與 預(yù)期一致。
[0043] (5)雙標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立：取帶有內(nèi)標(biāo)基因 Sey-tmt和⑶S外源基因的重組質(zhì)粒 DNA，分別作10倍梯度稀釋?zhuān)黄渲?，⑶S基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)所用標(biāo)準(zhǔn)品模板濃度梯度9. 18X107、 9· 18Χ106、9· 18Χ105、9· 18Χ104、9· 18X103copies/yL ;Sey-tmt 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)所用標(biāo)準(zhǔn)品模 板濃度梯度：4· 98Χ107、4· 98Χ106、4· 98Χ105、4· 98Χ104、4· 98X 103copies/yL ;以這些稀 釋的標(biāo)準(zhǔn)品重組質(zhì)粒DNA為模板分別進(jìn)行SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，其中，熒光實(shí)時(shí) 定量PCR反應(yīng)體系：SYBR混合液12. 5 μ L，Primer F 1 μ L，Primer R 1 μ L，模板重組質(zhì)粒 DNA 2 μ L，加無(wú)菌超純水至25 μ L ;熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)條件：95°C變性2min ;95°C變性 158,58°〇退火208,72°〇延伸308,40個(gè)循環(huán)；72°〇延伸30 8，可得熒光強(qiáng)度-循環(huán)數(shù)曲線(xiàn)， 見(jiàn)圖4、圖5所示，獲得雙標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：Sr γ -tmt內(nèi)標(biāo)基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y = -3· 389χ+42· 35, R2 = 0. 998 ;⑶S外源基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y = -3. 508X+41. 79,R2= 0. 999。從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)看這四個(gè)野生 種芝麻轉(zhuǎn)基因株系基因在模板拷貝數(shù)和Ct值之間具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，表明其定量PCR體 系適合用于樣品的定量檢測(cè)；并且本實(shí)施例建立的γ-tmt內(nèi)標(biāo)基因定量方法具有很好的 的重復(fù)性和再現(xiàn)性，對(duì)野生種芝麻轉(zhuǎn)GUS基因株系Tl代中GUS基因的拷貝數(shù)的檢測(cè)有很好 的穩(wěn)定性和可靠性。在95°C 15s，60°C 15s，95°C 15s(60°C至95°C設(shè)置為20min)制備溶解 曲線(xiàn)，獲得的溶解曲線(xiàn)為單峰，如圖6為內(nèi)標(biāo)基因 Sey-tmt溶解曲線(xiàn)，圖7為外源基因 GUS 溶解曲線(xiàn)，表明擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一，沒(méi)有非特異擴(kuò)增。
[0044] (6)外源基因拷貝數(shù)檢測(cè)：隨機(jī)挑選待測(cè)轉(zhuǎn)基因野生種芝麻No. Sr267、No. SrOOl、 No. Sr038和No. Srll-lNo. Srl3010等4個(gè)株系Tl代和2個(gè)非轉(zhuǎn)基因植株，分別選取各植 株幼嫩葉片，采用CTAB法提取DNA (參照CTAB法標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行），稀釋至300?500ng/ μ L 待用；取1 μ LDNA，分別對(duì)各樣品的Se γ -tmt內(nèi)標(biāo)基因和⑶S外源基因進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量 PCR。熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系：模板DNA 300?500ng，SYBR混合液12. 5 μ L，Primer F lyL，Primer R lyL，加無(wú)菌超純水至25yL;熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)條件：95°C變性2min， 95°〇變性158,58°〇退火208,72°〇延伸308,40個(gè)循環(huán)；72°〇延伸308。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)， 確定6份樣品中的外源基因拷貝數(shù)分別為3、1、4、1、0和0,檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。
[0045] 表2野生種芝麻轉(zhuǎn)基因株系外源基因拷貝數(shù)檢測(cè)
[0046]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種適合芝麻外源基因拷貝數(shù)檢測(cè)的內(nèi)標(biāo)基因，其特征在于，所述內(nèi)標(biāo)基因?yàn)?γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因 Sey-tmt，其核苷酸序列如SEQ ID No: 1所示或如SEQID No: 2 所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的適合芝麻外源基因拷貝數(shù)檢測(cè)的內(nèi)標(biāo)基因，其特征在于，所 述內(nèi)標(biāo)基因 SeY-tmt在芝麻栽培種中的拷貝數(shù)為單拷貝，在野生種的拷貝數(shù)為2拷貝。
3. -種如權(quán)利要求1或2所述的適合芝麻外源基因拷貝數(shù)檢測(cè)的內(nèi)標(biāo)基因的構(gòu)建方 法，其特征在于，包括以下步驟： (1)內(nèi)標(biāo)基因的克?。簭脑耘喾N芝麻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中挑選低拷貝的γ-生育酚甲基轉(zhuǎn) 移酶基因 Se γ -tmt，同時(shí)從已構(gòu)建的芝麻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中挑選Se γ -tmt基因的mRNA序列 (EST sequence，GenBank accession no. JP645320);根據(jù)已知兩端非同源區(qū)序列設(shè)計(jì)引 物，Southern blot探針用引物序列為SEQ ID No :3和SEQ ID No :4,分別在栽培種芝麻和 野生種芝麻中進(jìn)行基因序列PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR條帶回收并進(jìn)行測(cè)序；其序列如SEQ ID No: 1和SEQ ID No :2所示，序列比對(duì)確定，該部分序列分別在栽培種芝麻和野生種芝麻中的同 段序列相似度為97.8% ; ⑵內(nèi)標(biāo)基因 γ-tmt拷貝數(shù)鑒定：分別提取栽培種芝麻（S. indicum L.，2n = 26)和 野生種芝麻（S. radiatum，2n = 64)的基因組DNA，采用Southern Blot雜交方法對(duì)γ-tmt 基因在不同種芝麻中的拷貝數(shù)進(jìn)行鑒定，確定所述內(nèi)標(biāo)基因 γ-tmt在栽培種中的拷貝數(shù) 為單拷貝，在野生種的拷貝數(shù)為2拷貝； (3)內(nèi)標(biāo)基因 γ-tmt種間特異性和種內(nèi)非特異性鑒定：分別設(shè)計(jì)內(nèi)標(biāo)基因和外源基 因的熒光實(shí)時(shí)定量PCR引物，接著構(gòu)建帶有內(nèi)標(biāo)基因 PCR擴(kuò)增片段的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和外 源基因 PCR擴(kuò)增片段的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，然后分別將重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品做10倍梯度稀釋?zhuān)?度濃度在IX IO7?IX 10 3C〇py/μ L，然后以稀釋后的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分別作為模板，建立 以SYBR混合液為熒光指示劑的熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)的雙標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，用來(lái)檢測(cè)外源基 因，表明所述內(nèi)標(biāo)基因 γ-tmt具有種間特異性和種內(nèi)非特異性的特點(diǎn)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的適合芝麻外源基因拷貝數(shù)檢測(cè)的內(nèi)標(biāo)基因的構(gòu)建方法，其特 征在于，步驟（3)中，所述內(nèi)標(biāo)基因 γ-tmt熒光實(shí)時(shí)定量PCR引物的核苷酸序列為SEQ ID No :5和SEQ ID No :6 ;外源基因熒光實(shí)時(shí)定量PCR引物的核苷酸序列為SEQ ID No :7和 SEQ ID No :8〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的適合芝麻外源基因拷貝數(shù)檢測(cè)的內(nèi)標(biāo)基因的構(gòu)建方法，其特 征在于，步驟（3)中，所述內(nèi)標(biāo)基因 PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為長(zhǎng)度為155bp ;所述外源基因 PCR擴(kuò) 增片段長(zhǎng)度范圍為150?200bp。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的適合芝麻外源基因拷貝數(shù)檢測(cè)的內(nèi)標(biāo)基因的構(gòu)建方法，其特 征在于，步驟（3)中，所述重組質(zhì)粒的連接載體為pUCm-T中間載體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的適合芝麻外源基因拷貝數(shù)檢測(cè)的內(nèi)標(biāo)基因的構(gòu)建方法，其特 征在于，步驟（3)中所述 SYBR 混合液為 Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix。
8. 根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的適合芝麻外源基因拷貝數(shù)檢測(cè)的內(nèi)標(biāo)基因在定量檢測(cè)轉(zhuǎn) 基因芝麻轉(zhuǎn)基因成分中的應(yīng)用。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，分析外源基因在轉(zhuǎn)基因芝麻中的拷貝數(shù)。
【專(zhuān)利摘要】一種適合芝麻外源基因拷貝數(shù)檢測(cè)的內(nèi)標(biāo)基因及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，所述內(nèi)標(biāo)基因?yàn)棣?生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因Se？γ-tmt，其核苷酸序列如SEQ？ID？No：1所示或如SEQ？ID？No：2所示。本發(fā)明還包括所述內(nèi)標(biāo)基因的構(gòu)建方法以及所述利用內(nèi)標(biāo)基因，采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株DNA中的外源基因數(shù)量，從而確定外源基因在轉(zhuǎn)基因芝麻植株中的拷貝數(shù)中的應(yīng)用。本發(fā)明之適于芝麻外源基因拷貝數(shù)檢測(cè)的內(nèi)標(biāo)基因可以應(yīng)用于芝麻轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系評(píng)價(jià)、大規(guī)模轉(zhuǎn)基因芝麻的外源基因拷貝數(shù)分析、芝麻未知基因拷貝數(shù)評(píng)價(jià)與遺傳特征分析等研究，為今后芝麻功能基因組學(xué)研究和優(yōu)異芝麻新材料評(píng)價(jià)奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。同時(shí)本發(fā)明對(duì)芝麻外源基因拷貝數(shù)檢測(cè)操作步驟簡(jiǎn)單，結(jié)果可靠，為獲得高效穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因芝麻植株提供重要依據(jù)。
【IPC分類(lèi)】C12N15-54, C12Q1-68
【公開(kāi)號(hào)】CN104561313
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510010165
【發(fā)明人】苗紅梅, 張海洋, 魏利斌, 段迎輝, 李春, 韓秀花
【申請(qǐng)人】河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心
【公開(kāi)日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2015年1月8日