一種同時檢測馬和驢源性成分的雙重?zé)晒鈖cr方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及食品檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及檢測食品中馬和驢源性成分的雙重 熒光PCR檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，動物源性食品在人們?nèi)粘Ｉ攀持械谋壤鸩皆龃?，各種冷鮮肉、精深加工 的半成品肉、熟肉制品等消費(fèi)比例逐年上升。但不同物種的肉品質(zhì)和價格存在很大差異，給 摻雜摻假創(chuàng)造了極大的利潤空間。為了謀取經(jīng)濟(jì)利益，有些不法企業(yè)和商販在肉制品中使 用低成本肉代替高價位肉的現(xiàn)象時有發(fā)生。這不僅嚴(yán)重侵害了消費(fèi)者的健康和權(quán)益，還會 涉及宗教信仰，導(dǎo)致民族問題，同時直接影響到國家的形象，社會的和諧發(fā)展以及政府的公 信力。因此，研究出一種準(zhǔn)確、快速、可靠地鑒別動物源性成分的方法，就非常有必要。
[0003] 隨著分子生物學(xué)方法在食品檢驗(yàn)中的應(yīng)用不斷深入，食品中動物源性成分的鑒別 技術(shù)也在不斷發(fā)展，鑒別精度和檢測靈敏度的不斷提高，目前已初步形成了以基因檢測為 基礎(chǔ)的方法體系。以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)為基礎(chǔ)的技術(shù)已成為食品中動物源性成分鑒定 的核心方法。物種特異性PCR根據(jù)不同物種基因序列的差異位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物，利用PCR 反應(yīng)實(shí)現(xiàn)動物源性成分特征基因片段的指數(shù)級擴(kuò)增，繼而通過電泳檢測鑒別可能的物種成 分。多重PCR能夠?qū)崿F(xiàn)混合物中多個物種同時檢測。近年來，實(shí)時熒光PCR技術(shù)是動物源 性成分檢測中研究最多的方法，與普通PCR相比，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重現(xiàn)性好、有效 降低污染等優(yōu)點(diǎn)。
[0004] 哺乳動物線粒體DNA(mtDNA)在遺傳上相對獨(dú)立，具有基因組小、沒有重復(fù)序列、 生物個體內(nèi)無組織特異性、每個細(xì)胞中含有大量線粒體基因組等特點(diǎn)。因此，用mtDNA分子 標(biāo)記鑒別動物源性成分與核DNA分子標(biāo)記相比，具有靈敏度高、精確度好、DNA降解小等優(yōu) 勢?；趧游锞€粒體DNA的熒光PCR檢測技術(shù)在動物源性成分鑒別中具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0005] 目前，根據(jù)線粒體基因組DNA序列差異設(shè)計(jì)物種特異性引物，建立PCR與實(shí)時熒光 PCR方法已見大量報道，然而，針對馬和驢動物源性成分同時檢測的雙重?zé)晒釶CR方法尚未 見報導(dǎo)。因此，建立動物源性產(chǎn)品中馬、驢源性成分雙重實(shí)時熒光PCR檢測方法，對提高突 發(fā)事件應(yīng)急處理能力，提升食品安全風(fēng)險監(jiān)測水平和監(jiān)管能力具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種同時檢測馬和驢源性成分的雙重?zé)晒釶CR方法。
[0007] 本發(fā)明首先提供用于檢測、馬和驢源性成分的引物對以及熒光探針，其中用于檢 測馬源性成分的引物核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 1-2所示，探針序列如SEQ ID NO. 5所 示；用于檢測驢源性成分的引物核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 3-4所示，探針序列如SEQ ID NO. 6所示，兩條探針分別標(biāo)記不同的熒光素。
[0008] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，SEQ ID NO. 5所示的探針以FAM熒光素標(biāo)記，SEQ ID NO. 6 所示的探針以VIC熒光素標(biāo)記。
[0009] 本發(fā)明提供了上述引物對和熒光探針在檢測馬和驢源性成分中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明提供了上述引物對和熒光探針在制備檢測馬和驢源性成分試劑盒中的應(yīng) 用。
[0011] 含有本發(fā)明引物對和熒光探針的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的試劑 盒可以是由多個隔斷所形成，以容納固定一個或多個如管或小瓶的容器。這些容器之一或 者多個可以裝有本發(fā)明的引物以及熒光探針，根據(jù)需要該引物和熒光探針可以是凍干形式 或溶于緩沖液中的狀態(tài)。另外，本發(fā)明的試劑盒中還可以包括用于熒光定量PCR反應(yīng)的一 種或多種酶/試劑，以及實(shí)施本發(fā)明所需要的其它成分及用具，例如DNA裂解液、熒光定量 反應(yīng)液、陰性模板、陽性模板，所述陰性模板為雙蒸水，所述陽性模板為馬基因組DNA和驢 基因組DNA。
[0012] 進(jìn)一步地,本發(fā)明的試劑盒其20 μ L工作體系為：
[0013] 試劑 體積μι濃度 GoTaqii qPCR Master Mix 10,0 2 x 馬上游引物 0.5 10 μΜ 馬下游引物 0.5 10 μΜ 馬探針 0.5 10 μΜ 驢上游引物 0.5 10 μΜ 驢下游引物 0.5 10 μΜ 驢探針 0.5 10 μΜ DN A 模板 1.0 0.1 ,Ug /μ? - 0.5 tig /μι 去離子水 6.0
[0014] 本發(fā)明試劑盒的工作程序?yàn)椋侯A(yù)變性95°C IOmin ;再經(jīng)95°C變性15s，60°C退火 Imin, 40個循環(huán)。
[0015] 本發(fā)明每次檢測標(biāo)本時須設(shè)立陰性對照和陽性對照，在檢測中兩種對照為有效擴(kuò) 增時，樣本結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：
[0016] 有FAM和VIC熒光同時被檢出，且Ct值均〈35. 0時，判定為陽性，表明從樣品中同 時檢出馬和驢源性成分；
[0017] 有FAM熒光被檢出，且Ct值〈35. 0，但無 VIC熒光，判定為陽性，表明從樣品中檢出 馬源性成分；
[0018] 有VIC熒光被檢出，且Ct值〈35. 0，但無 FAM熒光，判定為陽性，表明從樣品中檢出 驢源性成分；
[0019] 無 FAM和VIC熒光被檢出，Ct值彡35. 0,判定為為陰性。
[0020] 本發(fā)明提供了一種同時檢測馬和驢源性成分的雙重?zé)晒釶CR方法，該方法以蛋白 酶K消化法提取的肉制品DNA為模板，利用SEQ ID NO. 1-4所述的引物和SEQ ID NO. 5-6 所述的熒光探針進(jìn)行雙重?zé)晒舛縋CR擴(kuò)增，根據(jù)Ct值判定結(jié)果。
[0021] 本發(fā)明方法中，雙重?zé)晒舛縋CR的條件為：95°C預(yù)變性IOmin ;95°C變性15s， 60°C退火lmin，40個循環(huán)。
[0022] 本發(fā)明試劑盒特異性好，檢測方法快速簡單，準(zhǔn)確性高，靈敏度好，為食品中馬和 驢源性成分的檢測提供了新的方法。本發(fā)明所述的熒光RCR技術(shù)可以準(zhǔn)確快速的實(shí)現(xiàn)對食 品中馬和驢源性成分的鑒別檢測，可在Ih?2h內(nèi)完成，具有快速、特異、敏感、高通量等優(yōu) 點(diǎn)，不僅能為檢測馬和驢源性食品提供新的方法，而且能有效抵御肉制品摻假，加大對消費(fèi) 者利益的保護(hù)力度。
【附圖說明】
[0023] 圖1為本發(fā)明試劑盒檢測馬源成分特異性檢測結(jié)果。
[0024] 圖2為本發(fā)明試劑盒檢測驢源成分特異性檢測結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神 和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0026] 若未特別指明，實(shí)施例中所用的化學(xué)試劑均為常規(guī)市售試劑，實(shí)施例中所用的技 術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0027] 實(shí)施例1引物的設(shè)計(jì)
[0028] 經(jīng)大量比對GenBank中COX 1基因，選取COX 1基因高度保守且具有物種特 異性基因序列為模板，設(shè)計(jì)馬COX 1/驢COX 1特異性引物對和Taqman MGB探針，分 別命名為馬 COX I-F(Pl)、馬 COX I-R(P2)、驢 COX I-F (P3)、驢 COX I-R(P4)、馬 COX I-FAM-MGB-Probe (Probe-P5)、驢 COX I-VIC-MGB-Probe (Probe-P6)，用于雙重 Taqman MGB 實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增的引物和探針序列如下：
[0029] PI:5'-AACCCCCCTATTCGTTTGATCT-3'
[0030] P2 ：5'-ACGGTCTGTGAGAAGCATGGT-3'
[0031] P3 ：5'-AGCCTCCTAATCCGTGCTGAA-3'