一種鑒別雜交石斑魚個體的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及石斑魚，尤其是涉及一種利用797bp的核基因蘭尼受體3 (RYR3)序列 片段和654bp線粒體COI基因片段快速、準確地鑒別雜交石斑魚個體的方法。
【背景技術】
[0002] 石斑魚類，一般指鱸形目石斑魚科下的所有魚類，全球共有16個屬160余種，我國 沿海分布11屬60余種。石斑魚屬熱帶亞熱帶魚類，喜棲息在沿岸島嶼附近的巖礁、砂礫、 珊瑚礁底質的海區(qū)。其不僅種類繁多，還具有非常重要的商業(yè)價值，是熱帶亞熱帶近岸巖灘 和珊瑚礁漁業(yè)的重要代表。但由于其為定居性魚類，長期以來相似生活環(huán)境造成的平行演 化使得它們在外部及骨骼形態(tài)上都表現(xiàn)出較高趨同性，許多種類之間缺乏可用于比較的同 源性狀，分類上多以條紋、斑點及體色作為主要依據。然而在不同生理條件下，許多石斑魚 類的體色花紋往往會發(fā)生明顯變化，某些種類的幼魚與成魚之間也有顯著差別，因此，石斑 魚類的分類一直是魚類系統(tǒng)分類學中的一個難題。
[0003] 盡管石斑魚有很重要的經濟和社會效益，但現(xiàn)階段對其野生資源的管理非常缺 乏，有些種類已面臨滅絕或處于瀕危的地位。石斑魚養(yǎng)殖業(yè)的興起在一定程度上緩解了對 其野生資源的捕撈壓力。石斑魚種間親緣關系較近，容易出現(xiàn)雜交現(xiàn)象，在生產上，為獲得 品性更為優(yōu)良的石斑魚，種間雜交的方法已被廣為應用。但由于石斑魚雜交后代可育，而雜 交后代由于與雙親的形似特征使得其極易混入進行雜交育種的親本群體，導致雜交子代的 品質出現(xiàn)嚴重衰退，優(yōu)良性狀消失。此外雜交個體的逃逸現(xiàn)象也會對野生群體的基因庫造 成一定影響，不利于種質資源的保護。因此有效的鑒別和管理雜交石斑魚無論對石斑魚遺 傳育種還是資源保護都是必不可少的。
[0004] 雜交石斑魚通常具有兩種不同親本的形態(tài)特征，非常容易造成混淆。這使得單從 形態(tài)鑒定雜交石斑魚要比鑒定純種魚類更加困難，因此我們希望能夠借助分子手段解決雜 交石斑魚鑒定這個問題。但是傳統(tǒng)條形碼基因（如COI)都是線粒體基因，由于線粒體為母 系遺傳，只含有母本的遺傳信息，因此無法鑒別某個個體是否為雜交種。核基因包含了雙方 親本的遺傳信息，理論上可以用作雜交種的鑒別，但目前國際上尚未有通用的核基因作為 可作為物種鑒定的標準基因。通過篩選，我們發(fā)現(xiàn)核基因蘭尼受體3 (RYR3)為單拷貝核基 因，且在石斑魚類中種內相對保守，而種間則存在較大變異，因此我們設計出一對適合在石 斑魚類中擴增核基因蘭尼受體3的通用引物，利用核基因與線粒體基因序列信息相結合的 方式，并借助NCBI上較全的石斑魚相關序列數據，提出了一種可快速準確鑒別雜交石斑魚 個體的技術方法。
[0005] 中國專利CN102373283A公開一種用于石斑魚成分鑒別的特異性寡核苷酸引物、 PCR檢測試劑盒和檢測方法，所述引物對由正向引物Grof和反向引物Gror組成，其核苷酸 序列見SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2。該發(fā)明具有引物特異性好，檢測方法快速準確的特點，為 進出口魚類食品安全提供了保證。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明旨在提供一種利用797bp的核基因蘭尼受體3 (RYR3)序列片段和線粒體 654bp的COI基因片段快速、準確地鑒別雜交石斑魚個體的方法。
[0007] 本發(fā)明包括以下步驟：
[0008] 1)提取石斑魚個體基因組DNA ;
[0009] 2)設計并合成一對石斑魚類核基因 RYR3的通用引物如下：
[0010] RYR3F15:5 ' -GGAACTATCGGTAAGCAGATGG-3 '
[0011] RYR3R849:5 ' -GCCAGTGAAGAGCATCCAGAAGAAG-3 '
[0012] 3)以步驟1)所得的基因組DNA為模版，對RYR3基因進行PCR擴增，得到的擴增產 物片段大小為797bp ;
[0013] 4)將步驟3)所得的PCR擴增產物直接測序，若所得序列無單核苷酸雜合位點，則 直接判斷該待測個體為純種石斑魚個體；
[0014] 5)若步驟4)所得序列存在單核苷酸雜合位點，則進一步將PCR產物通過瓊脂糖 凝膠電泳純化回收，鏈接至PMD19-T載體，轉化E. coli DH5a進行克隆，挑取陽性克隆，PCR 檢測并測序，最終得到兩個石斑魚RYR3等位基因序列；
[0015] 6)登陸NCBI，使用BLAST功能將步驟5)所得兩條RYR3等位基因序列與網站上所 有序列進行同源性比對，若兩條等位基因序列均與同種石斑魚同源性最高，則待測個體仍 為純種石斑魚；若兩條等位基因序列分別與兩個不同種類的石斑魚有最高的同源性，則該 待測石斑魚個體為雜交個體；
[0016] 7)為進一步確定雜交個體的雙方親本，以步驟1)所得的基因組DNA為模版，使用 魚類條形碼COI基因通用引物進行PCR擴增，并將PCR產物直接測序，得到該雜交石斑魚線 粒體COI基因序列；
[0017] 8)登陸NCBI，使用BLAST功能將步驟7)所得COI基因序列與網站上所有序列進 行同源性比對，與其同源性最高的種類即為該雜交石斑魚的母本；
[0018] 9)結合兩條RYR3等位基因序列對應的兩種石斑魚，排除與母本相同的種類，另一 個種類即為雜交石斑魚的父本。
[0019] 在步驟3)、7)中，所述？0?擴增的反應條件可為：94°0變性511^11，進入30個循環(huán) ： 94°C變性 30s，55°C退火，30s，72°C延伸 Imin ;最后 72°C延伸 5min。
[0020] 本發(fā)明利用797bp的核基因蘭尼受體3 (RYR3)序列片段和線粒體654bp的COI基 因片段，可快速、準確地鑒別雜交石斑魚個體。
【具體實施方式】
[0021] 以下實施例將對本發(fā)明作進一步說明。
[0022] 本發(fā)明實施例選用市場及養(yǎng)殖場上所購得的多種雜交和純種石斑魚進行鑒定。
[0023] 實施例1 :
[0024] 1)選取廣東大亞灣養(yǎng)殖場的"珍珠龍膽"石斑魚，經調研已知其為雜交個體，父本 為鞍帶石斑魚，母本為褐點石斑魚。按常規(guī)方法采用分氯仿抽提法提取基因組DNA ;
[0025] 2)合成一對石斑魚類核基因 RYR3的通用引物
[0026] RYR3F15:5 ' -GGAACTATCGGTAAGCAGATGG-3 '
[0027] RYR3R849:5 ' -GCCAGTGAAGAGCATCCAGAAGAAG-3 '
[0028] 3)以步驟1)所得基因組DNA為模版，對RYR3基因進行PCR擴增，反應條件為： 94°C變性5min，進入30個循環(huán)：94°C變性30s，55°C退火，30s，72°C延伸Imin ;最后72°C延 伸5min。得到的擴增產物片段大小為797bp ;
[0029] 4)將步驟3)所得PCR產物直接進行測序，