與甘藍(lán)育性緊密連鎖的InDel標(biāo)記及其檢測(cè)方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)輔助育種領(lǐng)域，特別涉及與甘藍(lán)育性緊密連鎖的InDel標(biāo) 記。
【背景技術(shù)】
[0002] 甘藍(lán)類(lèi)植物的種內(nèi)下分7個(gè)變種，S卩結(jié)球甘藍(lán)變種（Brassica oleracea var. capitata)，花挪菜變種（Brassica oleracea var.botrytis)，青花菜變種（Brassica oleracea var. italica)，抱子甘藍(lán)變種(Brassica oleracea var. gemmifera)，羽衣甘 藍(lán)變種（Brassica oleracea var. acephala)，球莖甘藍(lán)變種（Brassica oleracea var. caulorapa)和芥藍(lán)變種（Brassica oleracea var. alboglabra)。許多甘藍(lán)擁有豐富的對(duì) 人類(lèi)有益的蛋白質(zhì)、類(lèi)胡蘿卜素以及豐富的硫代葡萄糖苷等次生代謝物等等。其是我國(guó)重 要的蔬菜類(lèi)作物，其中結(jié)球甘藍(lán)（Brassica oleracea var. capitata)是我國(guó)僅次于白菜的 第二大葉用蔬菜。2010年甘藍(lán)類(lèi)蔬菜產(chǎn)量達(dá)到七千六百萬(wàn)噸的規(guī)模，產(chǎn)值約一百四十億美 J Ll 〇
[0003] 由于結(jié)球甘藍(lán)具有明顯的雜種優(yōu)勢(shì)，目前全世界幾乎所有主載品種均為雜交種。 利用雄性不育系生產(chǎn)雜種一代已經(jīng)成為雜優(yōu)選育的發(fā)展趨勢(shì)。
[0004] 在現(xiàn)有技術(shù)中，植物顯性不育的自然突變較為少見(jiàn)，甘藍(lán)類(lèi)蔬菜中目前僅發(fā)現(xiàn)了 兩個(gè)自然突變的顯性不育類(lèi)型，其中在1979年，首次由方智遠(yuǎn)院士發(fā)現(xiàn)的結(jié)球甘藍(lán)類(lèi)型中 顯性不育自然突變?yōu)槲覈?guó)特有的類(lèi)型，目前已經(jīng)成功地應(yīng)用于甘藍(lán)雜交優(yōu)勢(shì)的利用。
[0005] 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)該雄性不育基因的分子標(biāo)記，基因定位及基 因表達(dá)分析做了大量的研宄工作。王曉武等采用集群分析（BSA)法進(jìn)行了甘藍(lán)顯性雄性 不育基因連鎖的分子標(biāo)記研宄，篩選并獲得了與該不育基因遺傳距離為7. 148cM的RAPD 標(biāo)記，并將該標(biāo)記轉(zhuǎn)換成ERPAD和SCAR。劉玉梅等運(yùn)用RFLP技術(shù)，獲得最小遺傳距離為 I. 787cM的RFLP連鎖標(biāo)記。張新梅篩選并獲得了與該不育基因遺傳距離為2. 34cM的SRAP 標(biāo)記，并成功將三個(gè)標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記。
[0006] 但是，上述傳統(tǒng)的分子標(biāo)記具有檢測(cè)繁瑣，重復(fù)率低等諸多缺陷。因此，目前亟需 找到一種能夠簡(jiǎn)化檢測(cè)流程、并且重復(fù)率高的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供了根據(jù)可育和不育的芥藍(lán)的重測(cè)序數(shù)據(jù)確定了與甘藍(lán)育性緊密連鎖 的InDel標(biāo)記。InDel標(biāo)記是根據(jù)核酸序列長(zhǎng)短多態(tài)性設(shè)計(jì)的標(biāo)記。其通過(guò)傳統(tǒng)的PCR等 方法就能檢測(cè)，因此不存在以往的分子標(biāo)記的各種問(wèn)題。所以，確定與甘藍(lán)育性緊密連鎖的 InDel標(biāo)記為利用分子標(biāo)記輔助鑒定具有雜種優(yōu)勢(shì)的顯性核不育甘藍(lán)材料提供了高效途 徑，這對(duì)甘藍(lán)顯性細(xì)胞核不育的育性鑒定具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0008] 所述InDel標(biāo)記為CGAGG，其存在于與甘藍(lán)隱性可育緊密連鎖的結(jié)球甘藍(lán)基因組 1. 0版本（version 1. 0)上的一條9號(hào)染色體上，并且其在所述9號(hào)染色體的從5'端起的 第29436068-29436072位，但不存在于與甘藍(lán)顯性不育緊密連鎖的另一條9號(hào)染色體上。 [0009] 在此需要指出的是，雖然本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)材料取自芥藍(lán)，但是在甘藍(lán)蔬菜中，甘藍(lán)的 變種如花挪菜變種（B. oleracea var. botrytis)、青花菜變種（B. oleracea var. italica)、 抱子甘藍(lán)變種（B. oleracea var. gemmifera)、羽衣甘藍(lán)變種（B. oleracea var. acephala)、 球莖甘藍(lán)變種（B. oleracea var. caulorapa)和芥藍(lán)變種（B. oleracea var. alboglabra) 的基因組序列與已經(jīng)完成全基因組測(cè)序的結(jié)球甘藍(lán)變種（B. oleracea var. capitata) 的基因組序列是基本相同的，并且這些變種均包括相同的與甘藍(lán)育性緊密連鎖的InDel 標(biāo)記，因此結(jié)球甘藍(lán)變種（B. oleracea var. capitata)的全基因組序列可以作為芥藍(lán) (B. oleracea var. alboglabra)等變種的參考序列。進(jìn)而，在本發(fā)明中將上述InDel標(biāo)記 的位置定位于已測(cè)序的結(jié)球甘藍(lán)變種（B. oleracea var. capitata)的基因組上。并且，本 發(fā)明中所述"甘藍(lán)（B. oleracea)"包括花椰菜變種（B. oleracea var. botrytis)、青花菜變 種（B. oleracea var. italica)、抱子甘藍(lán)變種（B. oleracea var. gemmifera)、羽衣甘藍(lán)變 種（B. oleracea var. acephala)、球莖甘藍(lán)變種（B. oleracea var. caulorapa)和芥藍(lán)變種 (B. oleracea var. alboglabra)等。
[0010] 在本發(fā)明中，只要包含如上所述的InDel標(biāo)記的核苷酸序列，且位于所述的與甘 藍(lán)隱性可育緊密連鎖的9號(hào)染色體上的任意一段序列，稱(chēng)之為序列A ;只要包含如上所述的 InDel標(biāo)記的核苷酸序列，且位于所述的與甘藍(lán)顯性不育緊密連鎖的9號(hào)染色體上的任意 一段序列，稱(chēng)之為序列B。
[0011] 因此，本發(fā)明還提供了一種包含如上所述的InDel標(biāo)記的核苷酸序列，包括位于 所述的與甘藍(lán)隱性可育緊密連鎖的9號(hào)染色體上的序列A，和/或位于所述的與甘藍(lán)顯性 不育緊密連鎖的9號(hào)染色體上的序列B。例如，序列A可以為包含如上所述的InDel標(biāo)記 與甘藍(lán)隱性可育緊密連鎖的非9號(hào)染色體全序列，和/或序列B包含如上所述的InDel標(biāo) 記可以為與甘藍(lán)顯性不育緊密連鎖的非9號(hào)染色體全序列。但是，為了方便鑒定材料的育 性，一般來(lái)說(shuō)，沒(méi)有必要設(shè)計(jì)一段較長(zhǎng)的片段用于PCR擴(kuò)增或其他方式的鑒別，而是選取較 短的DNA片段用于PCR擴(kuò)增或其他方式的鑒別，例如選用的長(zhǎng)度可以為60-180bp，但一般不 會(huì)超過(guò)300bp。所以，在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述序列A為如Seq ID No. 1所示的序列； 所述序列B為如Seq ID No. 2所示的序列。
[0012] 在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述序列的上下游引物分別為如Seq ID No. 3和如Seq ID No. 4所示的序列。
[0013] 本發(fā)明又提供了一種檢測(cè)甘藍(lán)育性的方法，所述方法包：括利用如上所述的 InDel標(biāo)記檢測(cè)甘藍(lán)的測(cè)試株，當(dāng)所述測(cè)試株中的兩條染色體上均含有所述InDel標(biāo)記時(shí)， 其為隱性純合可育株；當(dāng)所述測(cè)試株中的兩條染色體上均不含所述InDel標(biāo)記時(shí)，其為顯 性純合不育株；當(dāng)所述測(cè)試株中的一條染色體上含有所述InDel標(biāo)記，另一條染色體上不 含所述InDel標(biāo)記時(shí)，其為顯性雜合不育株。
[0014] 在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，上述方法中的甘藍(lán)選自結(jié)球甘藍(lán)變種、花椰菜變種、青花 菜變種、抱子甘藍(lán)變種、羽衣甘藍(lán)變種、球莖甘藍(lán)變種和芥藍(lán)變種中的一種或多種。
[0015] 本發(fā)明另外提供了一種檢測(cè)甘藍(lán)育性的方法，所述方法包括：利用如上所述核苷 酸序列檢測(cè)甘藍(lán)的測(cè)試株，當(dāng)在所述測(cè)試株中僅檢測(cè)到序列A時(shí)，其為隱性純合可育株；當(dāng) 在所述測(cè)試株中僅檢測(cè)到序列B時(shí)，其為顯性純合不育株；當(dāng)在所述測(cè)試株中既檢測(cè)到序 列A，同時(shí)又檢測(cè)到序列B時(shí)，其為顯性雜合不育株。
[0016] 在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，在利用如上所述核苷酸序列的上述方法中的所述甘藍(lán)選 自結(jié)球甘藍(lán)變種、花椰菜變種、青花菜變種、抱子甘藍(lán)變種、羽衣甘藍(lán)變種、球莖甘藍(lán)變種和 芥藍(lán)變種中的一種或多種。
[0017] 本發(fā)明還提供了一種與甘藍(lán)育性緊密連鎖的InDel標(biāo)記的應(yīng)用，特別是在甘藍(lán)品 種選育中的應(yīng)用。
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