面可應(yīng)用于純化任何VLP及其變體。在一些實(shí)施方案中， VLP是屬于杯狀病毒科的病毒。在一些實(shí)施方案中，VLP是諾如病毒VLP，包括嵌合或工程 化變體。在一些實(shí)施方案中，VLP是沙波病毒VLP。
[0037] 還可以理解，本發(fā)明的方案可應(yīng)用于VLP純化，其導(dǎo)致活病毒傳染劑被除去。在一 些實(shí)施方案中，活病毒是無包膜病毒，例如細(xì)小病毒、輪狀病毒、和/或類似物。在一些實(shí)施 方案中，活病毒是有包膜病毒，例如桿狀病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、漂游病毒（errantivirus)、蟲媒 病毒（arbovirus)、呼吸道合胞病毒、和/或類似物。
[0038] 此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，用溶劑和/或去污劑處理是失活和除去病毒污染的有用步 驟，包括殘余桿狀病毒（如果VLP是使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的話）。因此，本發(fā)明的方法 可以額外或可選擇地包括至少一個(gè)色譜處理，其涉及用溶劑和/或去污劑處理與包含VLP 的組合物接觸的（例如色譜柱的）色譜材料，和/或在與色譜材料接觸之前，向包含VLP的 組合物中添加溶劑/去污劑。隨后將VLP從色譜材料上洗脫，并采用SDR Hyper-D除去殘 余溶劑/去污劑。
[0039] 此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，用一個(gè)或多個(gè)深層過濾器，例如硅藻土和/或合成深層過濾 器，進(jìn)行深層過濾是除去殘余污染核酸的有用步驟，包括桿狀病毒核酸（如果VLP是使用桿 狀病毒表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的話）。因此，本發(fā)明的方法可以額外或可選擇地包括通過深層過濾處 理澄清任何含有VLP和殘余污染核酸的溶液，從而產(chǎn)生純化的深層過濾溶液。
[0040] 本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，通過一種或多種上述處理產(chǎn)生的純化溶液可有利地導(dǎo)致純化溶 液與任何純化前溶液相比，殘余污染蛋白相對(duì)于VLP減少。因此，作為純化的結(jié)果，本發(fā)明 的溶液可以顯示殘余污染蛋白相對(duì)于VLP減少。
[0041] 本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，通過一種或多種上述處理產(chǎn)生的純化溶液可有利地導(dǎo)致與任何 純化前溶液相比，具有全長(zhǎng)VPl亞單位的VLP的VLP水平相對(duì)增加。因此，作為純化的結(jié)果， 本發(fā)明的溶液可以顯示具有全長(zhǎng)VPl亞單位的VLP的水平增加。
[0042] 純化病毒樣顆粒（VLP)的方法包括產(chǎn)生或獲得含有所述VLP的細(xì)胞裂解物、培養(yǎng) 物上清液或?yàn)V出液。該方法還包括將裂解物、上清液或?yàn)V出液的pH調(diào)節(jié)到小于大約5的pH 值，從而產(chǎn)生pH被調(diào)節(jié)的溶液。該方法還包括從包含VLP的pH被調(diào)節(jié)的溶液中除去非VLP 微粒/聚集物，從而產(chǎn)生純化溶液。
[0043] 在一些實(shí)施方案中，VLP生產(chǎn)產(chǎn)生了至少包含VLP的第一亞群和第二亞群以及其 他處理污染材料的細(xì)胞裂解物、培養(yǎng)物上清液或?yàn)V出液。在一些實(shí)施方案中，裂解物、上清 液或?yàn)V出液是批量（bulk)生產(chǎn)培養(yǎng)物，或者從批量生產(chǎn)培養(yǎng)物產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中， 裂解物、上清液或?yàn)V出液從已經(jīng)通過過濾和/或離心進(jìn)行了預(yù)澄清的培養(yǎng)物上清液獲得。
[0044] 在一些實(shí)施方案中，VLP的亞群根據(jù)它們對(duì)pH處理的不同響應(yīng)，根據(jù)所誘發(fā)的抗 原應(yīng)答，和/或根據(jù)結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行表征。因此，可以想象可能存在超過2種VLP亞群，這取 決于病毒。在一些實(shí)施方案中，所產(chǎn)生的VLP是諾如病毒VLP，包含具有全長(zhǎng)VPl亞單位的 諾如病毒VLP的第一亞群，和包含具有截短的VPl亞單位的諾如病毒VLP的第二亞群。在 一些實(shí)施方案中，諾如病毒VLP是如下的一種或多種：諾如病毒基因群I VLP，諾如病毒基 因群II VLP，諾如病毒基因群III VLP，諾如病毒基因群IV VLP，和諾如病毒基因群V VLP。 在一些實(shí)施方案中，VLP是酸穩(wěn)定的VLP。
[0045] 本發(fā)明的方法包括調(diào)節(jié)裂解物、上清液或?yàn)V出液的pH，以便將VLP與處理污染物 和異常形成的VLP樣結(jié)構(gòu)分離。處理污染物可以包括，但不僅限于，多糖，殘余污染蛋白如 宿主細(xì)胞蛋白，殘余污染核酸如宿主細(xì)胞核酸，脂質(zhì)，介質(zhì)成分，活傳染劑如活宿主細(xì)胞病 毒（例如桿狀病毒），和類似物，以及任何前述污染物的組裝物或聚集物。異常形成的VLP 樣結(jié)構(gòu)可以是任何與期望的VLP結(jié)構(gòu)不同的VLP結(jié)構(gòu)，所述不同是基于其對(duì)環(huán)境條件（例 如pH處理或溫度）的不同響應(yīng)，所誘發(fā)的抗原應(yīng)答，結(jié)構(gòu)差異，分離模式（例如色譜、沉淀 或過濾），和/或類似情況。
[0046] 在一些實(shí)施方案中，裂解物、上清液或?yàn)V出液的pH被調(diào)節(jié)到小于大約5,從而產(chǎn)生 pH被調(diào)節(jié)的溶液。在一些實(shí)施方案中，裂解物、上清液或?yàn)V出液的pH被調(diào)節(jié)到小于大約 4. 5,小于大約4,小于大約3. 5,小于大約3. 4,小于大約3. 3,小于大約3. 2,小于大約3. 1， 小于大約3,小于大約2. 9,小于大約2. 8,小于大約2. 7,小于大約2. 6,小于大約2. 5,小于 大約2,小于大約1.5,小于大約1，和其間的全部范圍/亞范圍。
[0047] 裂解物、上清液或?yàn)V出液的pH通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法進(jìn)行調(diào)節(jié)。在 一些實(shí)施方案中，pH通過向裂解物、上清液或?yàn)V出液添加一種或多種導(dǎo)致酸化的試劑而加 以調(diào)節(jié)。酸化劑的實(shí)例可以包括：鹽酸、乙酸、硫酸和磷酸。所添加試劑的pH、體積和組成 可以被合適地選擇，這是本領(lǐng)域已知的。
[0048] 在一些實(shí)施方案中，裂解物、上清液或?yàn)V出液pH調(diào)節(jié)和/或處理的時(shí)間為大約30 分鐘。在一些實(shí)施方案中，裂解物、上清液或?yàn)V出液pH調(diào)節(jié)和/或處理的時(shí)間為大約1小 時(shí)，大約2小時(shí)，大約3小時(shí)，大約4小時(shí)，大約5小時(shí)，大約10小時(shí)，大約15小時(shí)，大約20 小時(shí)，大約25小時(shí)，大約30小時(shí)，大約35小時(shí)，大約40小時(shí)，大約45小時(shí)，大約46小時(shí)， 大約47小時(shí)，大約48小時(shí)，和其間的所有范圍和/或亞范圍。
[0049] 在一些實(shí)施方案中，裂解物、上清液或?yàn)V出液包括VLP的第一亞群和第二亞群，如 早前所討論的，并且調(diào)節(jié)裂解物、上清液或?yàn)V出液的PH導(dǎo)致第一和第二亞群不均勻分布。 在一些實(shí)施方案中，pH處理導(dǎo)致在pH被調(diào)節(jié)的溶液中形成微粒和/或聚集物，VLP的第二 亞群基本上發(fā)現(xiàn)于所得微粒/聚集物中，而VLP的第一亞群保留在pH被調(diào)節(jié)的溶液的體積 內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，例如本文中純化的諾如病毒基因群II VLP，第二亞群包括含有截短 的VPl蛋白的VLP，相比之下，第一亞群包含具有全長(zhǎng)VPl蛋白的VLP。
[0050] 在一些實(shí)施方案中，純化VLP的方法進(jìn)一步包括將非VLP微粒/聚集物從pH被調(diào) 節(jié)的溶液中除去，從而產(chǎn)生純化溶液。在一些實(shí)施方案中，除去包括，但不僅限于，一種或多 種如下的處理：離心、沉淀、絮凝、沉降和過濾。在一些實(shí)施方案中，分離至少涉及離心，以除 去微粒/聚集物。
[0051] 在一些實(shí)施方案中，除去非VLP微粒/聚集物包括將VLP的第二亞群從pH被調(diào)節(jié) 的溶液中分離，從而產(chǎn)生純化溶液，其中純化溶液基本上保留VLP的第一亞群。換言之，微 粒/聚集物包括VLP的第二亞群。這樣，選擇除去非期望的VLP亞群可以在收獲處理的早 期階段實(shí)現(xiàn)，即在培養(yǎng)物澄清期間。
[0052] 在一些實(shí)施方案中，除去/澄清通過一個(gè)或多個(gè)過濾處理完成。合適的過濾包括， 但不僅限于，深層過濾、膜過濾、化學(xué)過濾、和/或類似方法。在一些實(shí)施方案中，至少一個(gè) 過濾處理是使用一個(gè)或多個(gè)深層過濾器的深層過濾。深層過濾可以指任何采用多孔過濾器 /過濾介質(zhì)的過濾處理。合適的深層過濾器包括，但不僅限于，硅藻土深層過濾器、合成深層 過濾器、和/或類似物。使用深層過濾器的好處包括容易操作和可以獲得一次性材料，避免 了重復(fù)使用裝置（reused equipment)所要求的清潔確認(rèn)。在一些實(shí)施方案中，也可以任意 地采用一種或多種額外的過濾處理，例如使用亞微米過濾器。
[0053] 在一些實(shí)施方案中，在這一步驟之后，VLP第一亞群與殘余污染蛋白的比值被增加 至少大約2倍。在一些實(shí)施方案中，VLP第一亞群與殘余污染蛋白的比值被增加至少大約3 倍，至少大約4倍，至少大約5倍，至少大約10倍，至少大約15倍，至少大約20倍，至少大 約50倍，至少大約75倍，至少大約100倍，和其間的所有數(shù)值。
[0054] 在一些實(shí)施方案中，在過濾之后，至少大約50 %的殘余污染核酸被從裂解物、上清 液或?yàn)V出液中除去。術(shù)語"殘余污染核酸"能夠包括，但不僅限于，宿主細(xì)胞核酸、宿主細(xì)胞 病毒的核酸、生產(chǎn)病毒（即用于產(chǎn)生VLP)的核酸，和/或類似物。在一些實(shí)施方案中，至 少大約55 %的殘余污染核酸，至少大約60 %的殘余污染核酸，至少大約61 %的殘余污染核 酸,至少大約62 %的殘余污染核酸，至少大約63 %的殘余污染核酸，至少大約64 %的殘余 污染核酸，至少大約65 %的殘余污染核酸，至少大約66 %的殘余污染核酸，至少大約67% 的殘余污染核酸，至少大約68 %的殘余污染核酸，至少大約69 %的殘余污染核酸，至少大 約70 %的殘余污染核酸，至少大約75 %的殘余污染核酸，至少大約80 %的殘余污染核酸， 至少大約85 %的殘余污染核酸，至少大約90 %的殘余污染核酸，至少大約91 %的殘余污 染核酸，至少大約92 %的殘余污染核酸，至少大約93 %的殘余污染核酸，至少大約94 %的 殘余污染核酸，至少大約95 %的殘余污染核酸，至少大約96 %的殘余污染核酸，至少大約 97 %的殘余污染核酸，至少大約98 %的殘余污染核酸，至少大約99 %的殘余污染核酸，至 少大約100%的殘余污染核酸，和其間的全部數(shù)值，被從裂解物、上清液或?yàn)V出液中除去。
[0055] -般地，VLP在特定處理步驟之后的純化程度可以通過VLP濃度與任何其他成分 濃度的比值變化進(jìn)行測(cè)量（相對(duì)于裂解物、上清液或?yàn)V出液）。例如，可以計(jì)算VLP濃度與 傳染劑濃度之間的比值，VLP濃度與殘余污染蛋白之間的比值，和/或VLP濃度與宿主細(xì)胞 處理污染物之間的比值。
[0056] 在一些實(shí)施方案中，純化VLP包括，在將VLP第二亞群從pH被調(diào)節(jié)的溶液中除去 之后，從純化溶液分離VLP的第一亞群。在一些實(shí)施方案中，將VLP第一亞群從純化溶液中 分離包括任何合適的分離處理，例如離心（如連續(xù)流）、沉淀、相分離、切向流過濾、緩沖液 交換方法，和/或類似方法。在一些實(shí)施方案中，將VLP第一群從純化溶液分離包括使用一 種或多種色譜處理。每一個(gè)色譜處理可以獨(dú)立地選自下組，但不僅限于，羥基磷灰石色譜、 疏水相互作用色譜、尺寸排阻色譜、離子交換色譜、混合模式色譜、和親和色譜。離子交換色 譜可以是陰離子交換色譜或陽離子交換色譜。
[0057] 在一些實(shí)施方案中，在這一步驟之后，VLP第一亞群與殘余污染蛋白的比值被增加 至少大約2倍。在一些實(shí)施方案中，VLP第一亞群與殘余污染蛋白的比值被增加至少大約 3倍，至少大約4倍，至少大約5倍，至少大約10倍，至少大約15倍，至少大約20倍，至少 大約50倍，至少大約75倍，至少大約100倍，和其間的所有數(shù)值。在一些實(shí)施方案中，在此 步驟之后，至少大約50%的殘余污染核酸被從裂解物、上清液或?yàn)V出液中除去。術(shù)語"殘余 污染核酸"能夠包括，但不僅限于，宿主細(xì)胞核酸、生產(chǎn)病毒核酸、病毒核酸、細(xì)菌核酸、真菌 核酸，來自其它可能與本文所述系統(tǒng)和方法有關(guān)或無關(guān)的生物體的核酸，和/或類似物。在 一些實(shí)施方案中，至少大約55%的殘余污染核酸，至少大約60%，至少大約61%，至少大約 62%，至少大約63%，至少大約64%，至少大約65%，至少大約66%，至少大約67%，至少 大約68%，至少大約69%，至少大約70%，至少大約75%，至少大約80%，至少大約85%， 至少大約90%，至少大約91%，至少大約92%，至少大約93%，至少大約94%，至少大約 95 %，至少大約96 %，至少大約97 %，至少大約98 %，至少大約99 %，至少大約100 %，和其 間的全部數(shù)值的殘余污染核酸，被從裂解物、上清液或?yàn)V出液中除去。
[0058] 本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，溶劑和/或去污劑處理步驟可用于將活病毒傳染劑（例如桿狀 病毒）從VLP制備物中純化除離。如早前提到的，溶劑和/或去污劑可以在與色譜柱接觸 之前添加到VLP制備物中，和/或能夠在與色譜柱接觸之前添加到批量溶液中，和/或能夠 在與VLP制備物接觸之后添加到色譜柱中。因此，盡管本文出于簡(jiǎn)化的目的通過柱上溶劑/ 去污劑處理進(jìn)行的描述，但是應(yīng)當(dāng)理解，這些可能性的每一個(gè)均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在這些 實(shí)施方案中，本發(fā)明方法包括產(chǎn)生或獲得含有VLP的細(xì)胞裂解物、培養(yǎng)物上清液或?yàn)V出液， 和使用多步色譜處理純化VLP。多步色譜處理中的至少一個(gè)色譜處理包括使裂解物、上清液 或?yàn)V出液與色譜材料接觸，其中VLP與所述色譜材料結(jié)合。至少一個(gè)色譜處理還包括用溶 劑和/或去污劑處理色譜材料。至少一個(gè)色譜處理進(jìn)一步包括在處理后將VLP從色譜材料 上洗脫。
[0059] 在一些實(shí)施方案中，至少一個(gè)色譜處理還包括用溶劑和/或去污劑處理色譜材 料。在一些實(shí)施方案中，色譜材料是色譜柱，并且處理包括用溶劑和/或去污劑的柱上處理 或清洗。可以采用任何合適的溶劑和/或去污劑。在一些實(shí)施方案中，溶劑是有機(jī)溶劑，并 且包括但不僅限于，如下的一種或多種：磷酸三丁酯（TnBP)。在一些實(shí)施方案中，去污劑包 括，但不僅限于，如下的一種或多種：Triton X-100、辛基酚環(huán)氧乙燒冷凝物（octylphenol ethyleneoxide condensate)、聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯（polyoxyethylene sorbitan monooleate)、和膽酸鈉，和其各種組合。組合物實(shí)例包括：非離子去污劑（包括Triton X-100和聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯），兩性離子去污劑（包括CHAPS和Zwittergent 3-12))和離子去污劑（包括膽酸鈉和二甲基二（十八烷基）溴化銨）。
[0060] 在一些實(shí)施方案中，溶劑和/或去污劑包括至少大約0.01 %去污劑（w/v)，至少 大約0. 1 %,至少大約0. 2%，至少大約0. 3%，至少大約0. 4%，至少大約0. 5%，至少大約 1 %,至少大約2%，至少大約3%，至少大約4%，至少大約5%，至少大約10%去污劑（w/ v)，和其間的所有數(shù)值。在一些實(shí)施方案中，溶劑和/或去污劑包括至少大約0. 01 %溶劑 (w/v)，至少大約0. 1%，至少大約0. 2%，至少大約0. 3%，至少大約0. 4%，至少大約0. 5%, 至少大約1%，至少大約2%，至少大約3%，至少大約4%，至少大約5%，至少大約10%溶 劑（w/v)，和其間的所有數(shù)值。在一些實(shí)施方案中，溶劑和/或去污劑額外地含有通用的生 物緩沖液（例如，乙酸、檸檬酸、組氨酸、磷酸、Tris、和/或類似物）和/或鹽（例如，氯化 鈉、氯化鉀、氯化鎂、和/或類似物）。