用于捕獲和釋放微生物的微結(jié)構(gòu)體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用于捕獲和釋放微生物的微結(jié)構(gòu)體。
【背景技術(shù)】
[0002]為了有效治療疑似敗血癥或菌血癥的患者，進(jìn)行血液培養(yǎng)物測(cè)試以便準(zhǔn)確地診斷出造成敗血癥的病原生物體和對(duì)該病原生物體有效的治療劑。一般而言，血液培養(yǎng)物測(cè)試通過(guò)以下程序進(jìn)行。首先，從患者體內(nèi)無(wú)菌采集血液。對(duì)于血液采集，使用如注射器等合適的工具來(lái)使皮膚免受正常存在于皮膚上的微生物和處于周遭環(huán)境中的微生物的污染。血樣與液體血液培養(yǎng)基混合，并在通常I至2天中觀察在37°C培養(yǎng)期間微生物是否生長(zhǎng)。接種有血液的培養(yǎng)基分別在有氧和無(wú)氧條件下培養(yǎng)。因此，能夠在培養(yǎng)基中培養(yǎng)出厭氧微生物(在氧氣存在下無(wú)法生長(zhǎng))以及好氧微生物(在氧氣存在下能夠生長(zhǎng))或者兼性厭氧微生物(在存在或不存在氧氣的情況下都能夠生長(zhǎng))。含培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶的底部通常涂覆有趨于在微生物生長(zhǎng)時(shí)變色或發(fā)出熒光的化學(xué)物質(zhì)。因此，能夠識(shí)別顏色變化或熒光的血液培養(yǎng)系統(tǒng)的使用使得能夠自動(dòng)檢測(cè)培養(yǎng)基中微生物的生長(zhǎng)。在將微生物從患者體內(nèi)提取出并進(jìn)行培養(yǎng)直至微生物的數(shù)目達(dá)到最佳水平(15細(xì)胞/ml)之后，執(zhí)行后續(xù)過(guò)程(例如，鑒定病原體株和抗生素易感性測(cè)試)。此時(shí)，需要純培養(yǎng)以便從血液培養(yǎng)物溶液中選擇性分離出病原體株并培養(yǎng)該病原體株。根據(jù)通用的純培養(yǎng)方法，血液培養(yǎng)后的培養(yǎng)物溶液(含有微生物)在瓊脂培養(yǎng)基上鋪板，以便獲得必需量的微生物。此時(shí)，微生物需要16小時(shí)至24小時(shí)來(lái)形成集落。常規(guī)的純培養(yǎng)方法要求相對(duì)較長(zhǎng)的時(shí)間，這使得對(duì)細(xì)菌敗血癥的治療效果顯著變差。因此，需要更短的培養(yǎng)時(shí)間以進(jìn)行更快速的抗生素易感性測(cè)試。
[0003]常規(guī)方法還需要將微生物從食物或天然環(huán)境中分離出以便鑒定并培養(yǎng)該微生物的過(guò)程。然而，以極小的量存在于此類(lèi)環(huán)境中的微生物不易進(jìn)行分離。即使微生物以相對(duì)較大的量存在時(shí)，也必須采用耗時(shí)的微生物培養(yǎng)過(guò)程來(lái)分離所述微生物。
[0004]因此，需要以有效且省時(shí)的方式從例如源自生物體的組織、血液、糞便和尿液、食物以及自然環(huán)境等各種環(huán)境中分離出微生物的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]根據(jù)本公開(kāi)的一個(gè)方面，提供了包含微結(jié)構(gòu)體的用于捕獲和釋放微生物的結(jié)構(gòu)體，每個(gè)微結(jié)構(gòu)體具有其上可附著一個(gè)或多個(gè)微生物的表面區(qū)域以及涂覆于所述微結(jié)構(gòu)體上且能夠通過(guò)人工控制而使微生物附著/解附的蛋白。
[0006]根據(jù)本公開(kāi)的另一方面，提供了利用微結(jié)構(gòu)體來(lái)捕獲和釋放微生物的方法，所述方法包括:提供涂覆有用于使微生物附著和解附的蛋白的微結(jié)構(gòu)體；在含有微生物的溶液中，將所述微結(jié)構(gòu)體與含有輔助微生物附著的物質(zhì)的溶液混合，以制備混合溶液；攪拌所述混合溶液以使微生物附著于微結(jié)構(gòu)體；從所述混合溶液中分離出附著有微生物的微結(jié)構(gòu)體；和降低輔助所述微生物附著的物質(zhì)的濃度，從而使微生物從微結(jié)構(gòu)體上解附。
【附圖說(shuō)明】
[0007]圖1是顯示細(xì)菌結(jié)合至人甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)或從其解離的模型的圖示。
[0008]圖2顯示了描繪細(xì)菌附著至MBL涂覆的微結(jié)構(gòu)體的狀態(tài)的(a)示意圖和(b)實(shí)際光學(xué)顯微圖片。
[0009]圖3是說(shuō)明捕獲和分離微生物的方法的一個(gè)實(shí)施方式的流程圖。
[0010]圖4顯示的光學(xué)顯微圖片示出了對(duì)抗體涂覆的微結(jié)構(gòu)體與MBL涂覆的微結(jié)構(gòu)體的細(xì)菌捕獲和釋放性質(zhì)進(jìn)行比較的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0011]圖5至8顯示了將附著至MBL涂覆的微結(jié)構(gòu)體和抗體涂覆的微結(jié)構(gòu)體的細(xì)菌從微結(jié)構(gòu)體分離并進(jìn)行培養(yǎng)之后，每小時(shí)記錄的細(xì)胞數(shù)。
【具體實(shí)施方式】
[0012]現(xiàn)將參照附圖詳細(xì)描述本公開(kāi)的實(shí)施方式。提供這些實(shí)施方式是為使本公開(kāi)完善，且這些實(shí)施方式將完整地向本領(lǐng)域技術(shù)人員表明本公開(kāi)的范圍。因此，本公開(kāi)可以實(shí)施為許多不同的形式，且不應(yīng)認(rèn)為其限于本文闡述的示例性實(shí)施方式。在附圖中，要素的尺寸，如寬度、長(zhǎng)度和厚度等，可能進(jìn)行了夸張放大以使其清晰。在整個(gè)附圖中，相同的附圖標(biāo)記表示相同要素。附圖是從觀察者的角度來(lái)解讀的。應(yīng)該理解，當(dāng)提及某要素處于另一要素“之上”時(shí)，其可直接位于所述另一要素上方，或者在兩者之間也可以存在一個(gè)或多于一個(gè)中間要素。
[0013]在一方面，本公開(kāi)提供了用于以容易的方式捕獲或釋放微生物的新型結(jié)構(gòu)體。本公開(kāi)的結(jié)構(gòu)體包括微結(jié)構(gòu)體，每個(gè)微結(jié)構(gòu)體具有其上可附著一個(gè)或多個(gè)微生物的表面區(qū)域以及涂覆于所述微結(jié)構(gòu)體上且能夠通過(guò)人工控制來(lái)使微生物附著/解附的蛋白。
[0014]微結(jié)構(gòu)體設(shè)計(jì)為在結(jié)構(gòu)上適于捕獲和釋放微生物。每個(gè)微結(jié)構(gòu)體的表面區(qū)域大至足以捕獲一個(gè)或多個(gè)微生物。即，每個(gè)微結(jié)構(gòu)體的尺寸都大于微生物的尺寸。
[0015]本文所用的術(shù)語(yǔ)“微結(jié)構(gòu)體”是指其尺寸等于或大于如細(xì)菌等微生物的尺寸的結(jié)構(gòu)體，且所述結(jié)構(gòu)體的最長(zhǎng)邊至少為I ym。例如，每個(gè)微結(jié)構(gòu)體可以是其寬度、厚度和長(zhǎng)度中的至少一個(gè)為I μ??至Imm的結(jié)構(gòu)體。微結(jié)構(gòu)體的寬度、厚度和長(zhǎng)度維度中的至少一個(gè)通?？梢允菙?shù)十至數(shù)百微米。微結(jié)構(gòu)體可以具有如球形、多面體、平面性或棒形結(jié)構(gòu)等各向同性結(jié)構(gòu)。作為選擇，微結(jié)構(gòu)體可以具有各向異性結(jié)構(gòu)，或者可以不定形。例如，微結(jié)構(gòu)體可以是直徑為數(shù)十微米的球形結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，微結(jié)構(gòu)體是寬度為數(shù)十微米的平面形或圓盤(pán)形結(jié)構(gòu)。當(dāng)微結(jié)構(gòu)體的形狀為平面形時(shí)，每個(gè)微結(jié)構(gòu)體可以附著至少一個(gè)微生物。另外，多個(gè)微生物附著并分布在平面形微結(jié)構(gòu)體的前側(cè)與后側(cè)。該平面分布有利于在用成像系統(tǒng)觀察微生物的后續(xù)過(guò)程中對(duì)目標(biāo)聚焦或者確定微生物的數(shù)目。
[0016]微結(jié)構(gòu)體可以通過(guò)多種技術(shù)制造。例如，可以使用美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)第2007/0105972號(hào)所公開(kāi)的連續(xù)流光刻法(continuous flow lithograph)或韓國(guó)專(zhuān)利第0875900號(hào)中公開(kāi)的利用數(shù)字微鏡裝置(DMD)的光流控光刻法(optofluidic lithography)來(lái)以更快更容易的方式制造具有各種形狀、尺寸和化學(xué)組成的微結(jié)構(gòu)體。
[0017]微結(jié)構(gòu)體可以是通過(guò)使例如紫外固化性聚合物或單體等固化性材料固化而生成的聚合物。所述固化性材料可包括能夠形成水凝膠的液相親水性聚合物。
[0018]此類(lèi)能形成水凝膠的固化性材料的實(shí)例包括:如聚二甲基硅氧烷等含硅聚合物、聚丙烯酰胺、聚氧乙烯、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚丙二醇二丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酸酯以及它們的共聚物。例如，由于作為固化性材料的聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG-DA)在聚乙二醇(PEG)鏈的兩端都具有丙烯酸酯官能團(tuán)，其能夠通過(guò)自由基聚合而交聯(lián)形成三維水凝膠。固化性材料還可以包括任何類(lèi)型的其狀態(tài)能夠從液態(tài)變?yōu)楣虘B(tài)的介質(zhì)。
[0019]用紫外光透過(guò)形成在數(shù)字微鏡裝置中的光掩膜圖案或掩膜圖案照射固化性材料使得能夠制造各種形式的微結(jié)構(gòu)體。
[0020]微結(jié)構(gòu)體涂覆有能夠通過(guò)人工控制而使微生物附著/解附的蛋白。所述蛋白使微結(jié)構(gòu)體適于捕獲和釋放微生物。蛋白的表面與微生物相互作用。蛋白的表面特征可以通過(guò)人工控制如pH、溫度和外部金屬離子濃度等因素而改變。例如，微結(jié)構(gòu)體可以在預(yù)定的pH范圍、預(yù)定的溫度范圍或預(yù)定的離子濃度范圍內(nèi)捕獲或釋放微生物。
[0021]每個(gè)微結(jié)構(gòu)體還可以包括具有官能團(tuán)的保護(hù)層。優(yōu)選地，使用以二氧化硅涂覆的層作為保護(hù)層。如羧基等官能團(tuán)的引入有助于涂覆用于使微生物附著/解附的蛋白(例如MBL)。
[0022]當(dāng)微結(jié)構(gòu)體基于水凝膠時(shí)，以二氧化硅涂覆的層增加了微結(jié)構(gòu)體的穩(wěn)定性并且防止MBL被吸附至水凝膠內(nèi)。用于引入MBL的官能團(tuán)可以通過(guò)以二氧化硅涂覆的層的表面-OH基團(tuán)而引入。
[0023]蛋白可以結(jié)合存在于微生物表面上的糖蛋白或糖。微生物例如可以為病毒、細(xì)菌和原生動(dòng)物。用于使微生物附著/解附的蛋白例如可以為鈣依賴性血清蛋白。具體地，所述鈣依賴性血清蛋白可以是甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)。甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)也稱甘露糖結(jié)合蛋白(MBP)。MBL是鈣離子(Ca2+)-依賴性凝集素(C型凝集素)，其活化凝集素途徑或者充當(dāng)調(diào)理素而顯著改善白細(xì)胞的吞噬作用。用于使微生物附著/解附的蛋白的特性可以通過(guò)輔助微生物附著的物質(zhì)而進(jìn)行人工控制。例如，MBL可以通過(guò)鈣離子而結(jié)合微生物。
[0024]圖1是顯示作為微生物的細(xì)菌結(jié)合作為蛋白的人甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)或從其上解離的模型的圖示。當(dāng)鈣離子(Ca2+)以高濃度存在時(shí)，MBL經(jīng)由鈣離子結(jié)合微生物細(xì)胞壁的糖殘基并以強(qiáng)作用力保持微生物(見(jiàn)圖1的(a))。同時(shí)，當(dāng)鈣離子(Ca2+)以低濃度存在時(shí)，MBL不再與微生物細(xì)胞壁結(jié)合，并且微生物因此得到釋放(見(jiàn)圖1的(b))。
[0025]參見(jiàn)圖1，MBL具有2至6個(gè)糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域(CRD)。MBL能通過(guò)鈣離子捕捉存在于如細(xì)菌等微生物表面上的糖。因此，MBL涂覆的微結(jié)構(gòu)體能夠在鈣離子以高濃度(例如，20mM以上)存在的環(huán)境中捕獲微生物。MBL能有利地高效捕獲激活所有類(lèi)型的細(xì)菌。通過(guò)降低環(huán)境鈣離子濃度能夠容易地將細(xì)菌與MBL分離。所收集的細(xì)菌可以進(jìn)行培養(yǎng)或者直接用于抗生素易感性測(cè)試(AST)。
[0026]圖2顯示了描繪細(xì)菌附著至MBL涂覆的微結(jié)構(gòu)體的狀態(tài)的(a)示意圖和(b)實(shí)際光學(xué)顯微圖片。圖2(b)顯示了作為細(xì)菌物種的枯草芽孢桿菌ATCC 6633附著至作為微結(jié)構(gòu)體的圓盤(pán)形PEG的狀態(tài)。微結(jié)構(gòu)體的直徑為100 μ m且高度為25 μ m。
[0027]在另一方面，本公開(kāi)提供了利用微結(jié)構(gòu)體捕獲和分離微生物的方法。圖3是說(shuō)明捕獲和分離微生物的方法的一個(gè)實(shí)施方式的流程圖。參照?qǐng)D3，在步驟SI中，提供了以用于使微生物附著/解附的蛋白涂覆的微結(jié)構(gòu)體。
[0028]在步驟S2中，在含微生物的溶液中，微結(jié)構(gòu)體與含有輔助微生物附著的物質(zhì)的溶液混合而制備混合溶液。微生物可以為例如，存在于一般培養(yǎng)溶液中的細(xì)菌、血液培養(yǎng)后的培養(yǎng)細(xì)菌或者存在于各種環(huán)境(例如，源自生物體的血液、糞便、尿液或組織、食物或天然環(huán)境)中的細(xì)菌。在微結(jié)構(gòu)體以MBL涂覆的情形中，含有輔助微生物附著的物質(zhì)的溶液可以為例如細(xì)胞用緩沖溶液，諸如含有鈣離子的TE或磷酸鹽緩沖鹽水。
[0029]在步驟S3中，攪拌混合溶液以使微生物附著至微結(jié)構(gòu)體。例如，可以通過(guò)在30°C至37°C以50rpm至10rpm搖振來(lái)適當(dāng)?shù)財(cái)嚢杌旌先芤骸?br>[0030]在步驟S4中，從混合溶液中分離出附著有微生物的微結(jié)構(gòu)體?？梢岳眠^(guò)濾來(lái)分離微結(jié)構(gòu)體。作為選擇，在微結(jié)構(gòu)體包含磁性材料時(shí)可以利用磁力分離。
[0031]在步驟S5中，微結(jié)構(gòu)體暴露于其中輔助微生物附著的物質(zhì)以低濃度存在的環(huán)境中。由于這種暴露之故，微生物能夠從微結(jié)構(gòu)體上解附。附著有微生物的微結(jié)構(gòu)體可以暴露于其中排除了輔助微生物附著的物質(zhì)的溶液，且因此能夠使微生物與微結(jié)構(gòu)體分離。例如，對(duì)于含有因鈣離子的存在而與微生物附著的MBL-微結(jié)構(gòu)體的溶液，可以用不含鈣離子