用于調(diào)節(jié)atp2a2表達(dá)的組合物和方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于調(diào)節(jié)ATP2A2表達(dá)的組合物和方法
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的奪叉引用
[0002] 本申請(qǐng)根據(jù)35U.S.C. § 119(e)要求2013年3月14日提交的名稱(chēng)為"用于調(diào) 節(jié) ATP2A2 表達(dá)的組合物和方法（COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING ATP2A2 EXPRESSION)"的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/785,832以及2012年5月16日提交的名稱(chēng)為"用于 調(diào)節(jié) ATP2A2 表達(dá)的組合物和方法（COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING ATP2A2 EXPRESSION)"的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/647, 925的權(quán)益，每個(gè)申請(qǐng)通過(guò)引用以其全文結(jié)合在 此。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及基于寡核苷酸的組合物，以及使用基于寡核苷酸的組合物用于治療疾 病的方法。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 心臟疾病包括心臟的許多疾病和障礙，包括先天性心臟病、主動(dòng)脈瘤、主動(dòng)脈夾 層、心律失常、心肌病、以及充血性心力衰竭。具體地,充血性心力衰竭在心臟不能維持機(jī)體 組織中充足的血液循環(huán)或不能泵出返回至其中的靜脈血時(shí)發(fā)生。心臟的弱化阻止其將足夠 量的氧循環(huán)到機(jī)體組織中。涉及收縮性的心臟疾病，例如充血性心力衰竭，取決于對(duì)心臟中 肌細(xì)胞的收縮/舒張循環(huán)的調(diào)節(jié)。
[0006] ATP酶，Ca++輸送，心肌，慢抽搐2 (ATP2A2)編碼肌質(zhì)網(wǎng)Ca++-ATP酶（SERCA)，其 是位于肌細(xì)胞的肌質(zhì)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的細(xì)胞內(nèi)泵。ATP2A2通過(guò)ATP的水解并且將鈣從胞質(zhì)溶膠 易位到肌質(zhì)網(wǎng)腔中來(lái)保持Ca2+離子的低胞質(zhì)濃度。鈣的這種輸送對(duì)于調(diào)節(jié)肌細(xì)胞的收縮 /舒張循環(huán)是重要的。含有突變體形式的ATP2A2的小鼠顯示出歸因于降低的ATP2A2活性 的一些心臟問(wèn)題。特別地，缺陷在心律、心搏量、心輸出、心臟肥大、以及充血性心力衰竭中 發(fā)生。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 在此披露的本發(fā)明的多個(gè)方面提供可用于上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ATP2A2的方法和組合物。 在一些實(shí)施例中，提供單鏈寡核苷酸，其靶向ATP2A2基因（例如，人ATP2A2)的PRC2相關(guān) 區(qū)并且因此引起該基因的上調(diào)。在一些實(shí)施例中，提供單鏈寡核苷酸，這些單鏈寡核苷酸靶 向編碼ATP2A2的基因的PRC2相關(guān)區(qū)。在一些實(shí)施例中，這些單鏈寡核苷酸通過(guò)緩解或阻 止PRC2介導(dǎo)的對(duì)ATP2A2的阻抑來(lái)激活或增強(qiáng)ATP2A2的表達(dá)。此處披露的本發(fā)明的多個(gè)方 面提供了可用于上調(diào)ATP2A2以治療和/或預(yù)防心臟疾?。òㄏ忍煨孕呐K病、主動(dòng)脈瘤、 主動(dòng)脈夾層、心律失常、心肌病、以及充血性心力衰竭）的方法和組合物。ATP2A2也與達(dá)里 耶-懷特（Darier-White)疾病、肌肉萎縮癥、以及疣狀肢端角化病相關(guān)。因此，此處披露的 本發(fā)明的某些方面提供了可用于上調(diào)ATP2A2以治療和/或預(yù)防達(dá)里耶-懷特疾病、肌肉萎 縮癥或疣狀肢端角化病的方法和組合物。
[0008] 本發(fā)明的另外的方面提供用于選擇用于激活或增強(qiáng)ATP2A2的表達(dá)的寡核苷酸的 方法。在一些實(shí)施例中，提供用于選擇一組寡核苷酸的方法，該組寡核苷酸中富集于用于激 活或增強(qiáng)ATP2A2的表達(dá)的候選物（例如，與寡核苷酸隨機(jī)選擇相比較）中。因此，這些方 法可以用于建立其中富集了激活或增強(qiáng)ATP2A2的表達(dá)的寡核苷酸的多組臨床候選物。這 類(lèi)庫(kù)可以被利用來(lái)例如鑒別用于開(kāi)發(fā)治療ATP2A2的治療劑的先導(dǎo)寡核苷酸。另外，在一些 實(shí)施例中，提供寡核苷酸化學(xué)性質(zhì)，其可用于控制用于激活A(yù)TP2A2的表達(dá)的單鏈寡核苷酸 的藥物代謝動(dòng)力學(xué)、生物分布、生物可利用性和/或功效。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的一些方面，提供單鏈寡核苷酸，這些單鏈寡核苷酸具有與ATP2A2基 因的PRC2相關(guān)區(qū)（例如，該區(qū)的至少8個(gè)連續(xù)核苷酸）（例如，如SEQ ID NO :1或2中給出 的核苷酸序列的PRC2相關(guān)區(qū)）互補(bǔ)的區(qū)。在一些實(shí)施例中，寡核苷酸具有以下特征中的至 少一個(gè)：a)為5'X-Y-Z的一個(gè)序列，其中X為任何核苷酸并且其中X位于寡核苷酸的5'端， Y為非為微小RNA的人種子序列的、長(zhǎng)度為6個(gè)核苷酸的核苷酸序列，并且Z為長(zhǎng)度為1至 23個(gè)核苷酸的核苷酸序列；b)不包括三個(gè)或更多個(gè)連續(xù)鳥(niǎo)苷核苷酸的序列；c)與每個(gè)核苷 酸序列具有閾值水平以下的序列一致性的序列，這些核苷酸長(zhǎng)度等于第二核苷酸序列、在 脫靶基因的5'端上游的50千堿基與該脫靶基因的3'端下游的50千堿基之間；d)與編碼 RNA的PRC2相關(guān)區(qū)互補(bǔ)的序列，該RNA形成包括至少兩個(gè)單鏈環(huán)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；以及e)具有 60 %以上G-C含量的一個(gè)序列。在一些實(shí)施例中，該單鏈寡核苷酸具有各自獨(dú)立地選擇的 特征a)、b)、c)、d)以及e)中的至少兩種。在一些實(shí)施例中，該單鏈寡核苷酸具有各自獨(dú) 立地選擇的特征a)、b)、c)、d)以及e)中的至少三種。在一些實(shí)施例中，該單鏈寡核苷酸 具有各自獨(dú)立地選擇的特征8)、13)、(3)、(1)以及6)中的至少四種。在一些實(shí)施例中，該單 鏈寡核苷酸具有特征a)、b)、c)、d)以及e)中的每一種。在某些實(shí)施例中，該寡核苷酸具 有序列5' X-Y-Z，其中該寡核苷酸的長(zhǎng)度為8至50個(gè)核苷酸。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的一些方面，提供具有序列X-Y-Z的單鏈寡核苷酸，其中X為任何核苷 酸，Y為非為人微小RNA的種子序列的、長(zhǎng)度為6個(gè)核苷酸的核苷酸序列，并且Z為長(zhǎng)度為1 至23個(gè)核苷酸的核苷酸序列，其中該單鏈寡核苷酸與ATP2A2基因的PRC2相關(guān)區(qū)（例如， 如SEQ ID NO :1或2中給出的核苷酸序列的PRC2相關(guān)區(qū)）互補(bǔ)。在本發(fā)明的一些方面中， 提供具有序列5' -X-Y-Z的單鏈寡核苷酸，其中X為任何核苷酸，Y為非為人微小RNA的種 子序列的、長(zhǎng)度為6個(gè)核苷酸的核苷酸序列，并且Z為長(zhǎng)度為1至23個(gè)核苷酸的核苷酸序 列，其中該單鏈寡核苷酸與ATP2A2基因的PRC2相關(guān)區(qū)（例如，如SEQ ID N0:1或2中給出 的核苷酸序列的PRC2相關(guān)區(qū)）的至少8個(gè)連續(xù)核苷酸互補(bǔ)。在一些實(shí)施例中，Y為選自表 1的序列。在一些實(shí)施例中，該P(yáng)RC2相關(guān)區(qū)為SEQ ID NO :5至88中任一個(gè)中列出的序列。
[0011] 在一些實(shí)施例中，該單鏈寡核苷酸包括如SEQ ID NO :89至59739中任一個(gè)中給出 的核苷酸序列，或其至少8個(gè)核苷酸的片段。在一些實(shí)施例中，該單鏈寡核苷酸包括如SEQ ID NO :89至59739中任一個(gè)中給出的核苷酸序列，其中所提供的核苷酸序列的5'端是該 寡核苷酸的5'端。在一些實(shí)施例中，該互補(bǔ)區(qū)（例如，至少8個(gè)連續(xù)核苷酸）還存在于如 SEQ ID NO :3或4中給出的核苷酸序列中。
[0012] 在一些實(shí)施例中，該單鏈寡核苷酸包括如SEQ ID NO :89至59739中任一個(gè)中給出 的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，該單鏈寡核苷酸包括如SEQ ID NO :89至59739中任一個(gè) 中給出的核苷酸序列中至少8個(gè)核苷酸的片段。
[0013] 在一些實(shí)施例中，該P(yáng)RC2相關(guān)區(qū)為SEQ ID NO :5至70中任一個(gè)中列出的序列。 在一些實(shí)施例中，該單鏈寡核苷酸包括如SEQ ID NO :89至41645中任一個(gè)中給出的核苷酸 序列，或其至少8個(gè)核苷酸的片段。在一些實(shí)施例中，該單鏈寡核苷酸包括如SEQ ID NO: 89至41645中任一個(gè)中給出的核苷酸序列，其中在SEQ ID NO :89至41645中任一項(xiàng)中提 供的核苷酸序列的5'端是該寡核苷酸的5'端。在一些實(shí)施例中，該至少8個(gè)連續(xù)核苷酸 還存在于如SEQ ID NO :3中給出的核苷酸序列中。
[0014] 在一些實(shí)施例中，該P(yáng)RC2相關(guān)區(qū)為SEQ ID NO :71至88中任一個(gè)中列出的序列。 在一些實(shí)施例中，該單鏈寡核苷酸包括如SEQ ID NO :41548至59739中任一個(gè)中給出的核 苷酸序列，或其至少8個(gè)核苷酸的一個(gè)片段。在一些實(shí)施例中，該單鏈寡核苷酸包括如SEQ ID NO :41548至59739中任一個(gè)中給出的核苷酸序列，其中在SEQ ID NO :41548至59739中 任一項(xiàng)中提供的核苷酸序列的5'端是該寡核苷酸的5'端。在一些實(shí)施例中，該至少8個(gè) 連續(xù)核苷酸存在于如SEQ ID NO :4中給出的核苷酸序列中。
[0015] 在一些實(shí)施例中，單鏈寡核苷酸包括如表3中給出的核苷酸序列。在一些實(shí)施例 中，該單鏈寡核苷酸包括如表3中給出的核苷酸序列中至少8個(gè)核苷酸的片段。在一些實(shí) 施例中，單鏈寡核苷酸由如表3中給出的核苷酸序列組成。
[0016] 在一些實(shí)施例中，該單鏈寡核苷酸不包括三個(gè)或更多個(gè)連續(xù)鳥(niǎo)苷核苷酸。在一些 實(shí)施例中，該單鏈寡核苷酸不包括四個(gè)或更多個(gè)連續(xù)鳥(niǎo)苷核苷酸。
[0017] 在一些實(shí)施例中，該單鏈寡核苷酸的長(zhǎng)度為8至30個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施例中， 該單鏈寡核苷酸的長(zhǎng)度高達(dá)50個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施例中，該單鏈寡核苷酸的長(zhǎng)度為8至 10個(gè)核苷酸，并且該P(yáng)RC2相關(guān)區(qū)的互補(bǔ)序列中除1、2或3個(gè)核苷酸之外的所有都為胞嘧啶 或鳥(niǎo)苷核苷酸。
[0018] 在一些實(shí)施例中，該單鏈寡核苷酸與ATP2A2基因的PRC2相關(guān)區(qū)、例如SEQ ID NO : 1或2中給出的核苷酸序列的PRC2相關(guān)區(qū)的至少8個(gè)連續(xù)核苷酸互補(bǔ)，其中該單鏈寡核苷 酸的核苷酸序列包括選自下組的核苷酸序列中的一個(gè)或多個(gè)，該組由以下各項(xiàng)組成：
[0019] (a) (X)Xxxxxx, (X)xXxxxx, (X)xxXxxx, (X)xxxXxx, (X)xxxxXx 和（X)xxxxxX，
[0020] (b)(X)XXxxxx, (X)XxXxxx, (X)XxxXxx, (X) XxxxXx, (X)XxxxxX, (X)xXXxxx, (X) xXxXxx, (X)xXxxXx, (X)xXxxxX, (X)xxXXxx, (X)xxXxXx, (X) xxXxxX, (X) xxxXXx, (X)xxxXxX 和（X)xxxxXX,
[0021] (c)(X)XXXxxx， （X)xXXXxx， （X)xxXXXx， （X)xxxXXX， （X)XXxXxx， （X)XXxxXx， （X) XXxxxX, (X)xXXxXx, (X)xXXxxX, (X)xxXXxX, (X)XxXXxx, (X)XxxXXx (X)XxxxXX, (X)xXxXXx, (X)xXxxXX， （X)xxXxXX， （X)xXxXxX 和（X)XxXxXx，
[0022] (d)(X)xxXXX， （X)xXxXXX， （X)xXXxXX， （X)xXXXxX， （X)xXXXXx， （X)XxxXXXX， （X) XxXxXX， （X)XxXXxX， （X)XxXXx， （X)XXxxXX， （X)XXxXxX， （X)XXxXXx， （X)XXXxxX， （X)XXXxXx， 和⑴ XXXXxx，
[0023] (e) (X) xXXXXX，（X) XxXXXX，（X) XXxXXX，（X) XXXxXX，（X) XXXXxX 和（X) XXXXXx，以及
[0024] (f) XXXXXX、XxXXXXX、XXxXXXX、XXXxXXX、XXXXxXX、XXXXXxX 以及 XXXXXXx，其中 " X " 表示核苷酸類(lèi)似物，（X)表示任選的核苷酸類(lèi)似物，并且"x"表示DNA或RNA核苷酸單位。
[0025] 在一些實(shí)施例中，該寡核苷酸的至少一個(gè)核苷酸為核苷酸類(lèi)似物。在一些實(shí)施例 中，與不具有至少一個(gè)核苷酸類(lèi)似物的寡核苷酸相比較，該至少一個(gè)核苷酸類(lèi)似物導(dǎo)致該 寡核苷酸的的Tm在1°C至5°C的范圍內(nèi)的升高。
[0026] 在一些實(shí)施例中，該寡核苷酸的至少一個(gè)核苷酸包括2' 0-甲基。在一些實(shí)施例 中，該寡核苷酸的每個(gè)核苷酸包括2' 0-甲基。在一些實(shí)施例中，該寡核苷酸包括至少一個(gè) 核糖核苷酸、至少一個(gè)脫氧核糖核苷酸或至少一個(gè)橋連核苷酸。在一些實(shí)施例中，該橋連核 苷酸為L(zhǎng)NA核苷酸、cEt核苷酸或ENA修飾的核苷酸。在一些實(shí)施例中，該寡核苷酸的每個(gè) 核苷酸為L(zhǎng)NA核苷酸。
[0027] 在一些實(shí)施例中，該寡核苷酸的核苷酸包括交替的脫氧核糖核苷酸以及 2' -氟-脫氧核糖核苷酸。在一些實(shí)施例中，該寡核苷酸的核苷酸包括交替的脫氧核糖核 苷酸以及2' -0-甲基核苷酸。在一些實(shí)施例中，該寡核苷酸的核苷酸包括交替的脫氧核糖 核苷酸以及ENA核苷酸類(lèi)似物。在一些實(shí)施例中，該寡核苷酸的核苷酸包括交替的脫氧核 糖核苷酸以及LNA核苷酸。在一些實(shí)施例中，該寡核苷酸的5'核苷酸為脫氧核糖核苷酸。 在一些實(shí)施例中，該寡核苷酸的核苷酸包括交替的LNA核苷酸和2' -0-甲基核苷酸。在一 些實(shí)施例中，該寡核苷酸的5'核苷酸為L(zhǎng)NA核苷酸。在一些實(shí)施例中，該寡核苷酸的核苷 酸包括通