葡萄糖的生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及使用嗜熱厭氣性微生物將纖維素分解來生產(chǎn)葡萄糖的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蔗渣、稻梗、稻谷殼、蘑菇廢菌床、堆肥、木材碎肩等纖維素系生物質(zhì)作為不對糧食 生產(chǎn)形成壓力的能量和/或化學(xué)工業(yè)的原料資源而受到了人們關(guān)注。特別是在纖維素系生 物質(zhì)向燃料乙醇的轉(zhuǎn)換方面，人們迫切期望開發(fā)出一種高效地將發(fā)酵原料糖化的技術(shù)。
[0003] 然而，與淀粉相比纖維素系生物質(zhì)的糖化技術(shù)的難度高。其原因在于，作為纖維素 系生物質(zhì)的構(gòu)成主體的纖維素是具有堅(jiān)固的晶體結(jié)構(gòu)的難分解性的高分子多糖。
[0004] 纖維素系生物質(zhì)的糖化方法中，已知有物理性糖化、化學(xué)性糖化以及酶糖化這3 種方法。
[0005] 物理性糖化處理中有球磨機(jī)、振動磨或蒸煮爆碎、加壓熱水處理等物理性地實(shí)施 糖化的處理，但是物理性處理需要大量能量，因而大多作為化學(xué)性糖化和/或酶糖化的前 處理而被并用。
[0006] 化學(xué)性糖化處理中有利用堿、酸的處理，自古以來通常使用酸糖化。酸糖化中有濃 硫酸糖化法和稀硫酸二階段糖化法，但是由于均使用硫酸，因此需要進(jìn)行廢棄物處理、降低 環(huán)境負(fù)荷，可以說在低成本化和能量轉(zhuǎn)換效率方面存在限制。
[0007] 酶糖化與酸糖化相比，具有廢液回收、處理的負(fù)荷輕、可降低耐化學(xué)品設(shè)備等設(shè)備 成本、不引起過度分解且糖的收率高等優(yōu)點(diǎn)，因而在大量含有淀粉質(zhì)的生物質(zhì)的酶糖化方 面得到實(shí)用化。但是，關(guān)于纖維素系生物質(zhì)，如前所述，纖維素具有晶體結(jié)構(gòu)以及具有半纖 維素、木質(zhì)素包圍結(jié)晶性纖維素而成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，因此與淀粉系相比，酶糖化是極其困難 的。
[0008] 作為可將纖維素系生物質(zhì)分解的半纖維素酶和/或纖維素酶，人們正在積極地研 宄著來自需氧性絲狀菌木霉屬（Trichoderma)微生物的酶（參照專利文獻(xiàn)1)。
[0009] 另外，近年來已清楚，某種厭氣性微生物生產(chǎn)酶復(fù)合體纖維體（Cellulosome)，其 將纖維素高效地分解為纖維寡糖（參照專利文獻(xiàn)2)。
[0010] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0011] 專利文獻(xiàn)
[0012] 專利文獻(xiàn)1 :日本特開2007-319040號公報(bào)
[0013] 專利文獻(xiàn)2 :日本特開2011-115110號公報(bào)
[0014] 非專利文獻(xiàn)
[0015] 非專利文獻(xiàn) I !Science 333 PP. 1279-1282(2011)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 發(fā)明所要解決的課題
[0017] 在使用來自微生物的纖維素分解酶將纖維素分解的方法中，為了獲得如來自木霉 屬微生物的酶或來自厭氣性微生物的纖維體那樣的纖維素分解酶，需要進(jìn)行如下的二階段 步驟的操作：首先，培養(yǎng)微生物獲得含有酶的培養(yǎng)液，接著，向含有酶的培養(yǎng)液中添加纖維 素進(jìn)行分解反應(yīng)。
[0018] 然而，在產(chǎn)生纖維體的厭氣性微生物的情況下，微生物的增殖速度遲緩，細(xì)胞密度 也低，因而存在為了獲得含有酶的培養(yǎng)液而需要很多時(shí)間這樣的問題。此外，由于作為纖維 素分解的終產(chǎn)物的纖維二糖的蓄積抑制纖維素酶的酶活性，因而存在分解反應(yīng)的后期纖維 素分解效率降低這樣的問題。
[0019] 關(guān)于來自瑞氏木霉（Trichoderma reesei)的纖維素分解酶，有人指出基質(zhì)的分解 速度遲緩，因而在實(shí)用化時(shí)需要大量的酶。
[0020] 鑒于上述或者后述的各種的課題，本發(fā)明的目的在于提供一種方法，其不需要獲 得含有酶的培養(yǎng)液的步驟，即可將纖維素高效地分解，從而制造葡萄糖。
[0021] 某種微生物特別是嗜熱厭氣性微生物雖然產(chǎn)生如纖維素分解酶那樣的糖酵解酶， 但是并不產(chǎn)生葡萄糖苷酶，或者即使生產(chǎn)也僅顯示非常低的活性。關(guān)于這樣的產(chǎn)生纖 維素分解酶的嗜熱厭氣性微生物，已知特別是葡萄糖的攝入能力緩慢，其偏好作為纖維素 分解酶反應(yīng)產(chǎn)物的纖維二糖等纖維寡糖并將其作為營養(yǎng)源而用于增殖中。因此，在將產(chǎn)生 纖維素分解酶的嗜熱厭氣性微生物在β-葡萄糖苷酶的共存下培養(yǎng)的情況下，所產(chǎn)生的纖 維寡糖和/或纖維二糖迅速地轉(zhuǎn)換為葡萄糖。另一方面，在這些嗜熱厭氣性微生物中，也確 認(rèn)有葡萄糖利用性能，通常，如果存在葡萄糖則可進(jìn)行生長并將該葡萄糖消耗。與在嗜熱厭 氣性微生物和β -葡萄糖苷酶共存的情況、將纖維二糖等纖維寡糖用做碳源的情況相比， 微生物的增殖有可能變得不良，有可能引起纖維素分解酶的生產(chǎn)降低，使纖維素分解降低 或者停止。
[0022] 本發(fā)明人等研宄了：將嗜熱厭氣性微生物在纖維素的存在下培養(yǎng)，利用葡 萄糖苷酶在培養(yǎng)基中將生成的纖維素分解物即纖維寡糖轉(zhuǎn)換為葡萄糖。原認(rèn)為即使存在 β-葡萄糖苷酶，在熱纖梭菌（Clostridium thermocellum)培養(yǎng)基中的纖維素分解速度也 與不存在的情況相同是不變的，即分解不良，但是令人驚訝的是知道了，存在葡萄糖苷 酶時(shí)可將纖維素高濃度分解。此外，其分解得到的纖維素的最終分解產(chǎn)物即葡萄糖的大部 分未被利用而蓄積在培養(yǎng)基中，本發(fā)明人等著眼于此而完成了本發(fā)明。
[0023] 推測嗜熱厭氣性微生物從培養(yǎng)初期開始，利用通過產(chǎn)生纖維素酶和分解纖維素而 生成的纖維二糖、纖維寡糖進(jìn)行增殖，并研宄了如通常那樣伴隨著菌體增殖而生產(chǎn)酶。然而 菌體濃度的增加使得酶生產(chǎn)進(jìn)展，并且纖維素分解酶在增加時(shí)，纖維素分解的速度提高，在 共存的β-葡萄糖苷酶的作用下，游離的纖維寡糖迅速地被分解為葡萄糖?？墒?，嗜熱厭氣 性微生物原本的葡萄糖利用性能緩慢，因而無法將已轉(zhuǎn)換的葡萄糖良好地利用，從而可以 解釋葡萄糖得以蓄積。
[0024] S卩，本發(fā)明通過在將嗜熱厭氣性細(xì)菌與纖維素培養(yǎng)時(shí)使葡萄糖苷酶存在，從 而利用了纖維寡糖轉(zhuǎn)換為葡萄糖的現(xiàn)象與葡萄糖的利用速度停滯的現(xiàn)象的時(shí)間差。當(dāng)產(chǎn)生 纖維素分解酶的嗜熱厭氣性微生物的葡萄糖利用性能緩慢時(shí)，則可預(yù)見若葡萄糖利用性能 緩慢則對微生物增殖和/或酶生產(chǎn)產(chǎn)生負(fù)影響，此外葡萄糖通常是對微生物而言非常容易 利用的糖源，因此基于上述預(yù)見和常識，很難想到如本發(fā)明這樣微生物不利用葡萄糖而將 之蓄積在培養(yǎng)基中，因此這是僅通過目前為止的認(rèn)識和/或信息無論如何也不能想到的認(rèn) 識。
[0025] 用于解決課題的手段
[0026] S卩，本發(fā)明涉及一種葡萄糖的生產(chǎn)方法，其特征在于，在纖維素的存在下培養(yǎng)嗜熱 厭氣性微生物時(shí)使葡萄糖苷酶共存。其中，微生物優(yōu)選為厭氣性微生物，進(jìn)一步優(yōu)選為 可將纖維素、半纖維素分解的嗜熱厭氣性微生物。
[0027] 本發(fā)明還提供一種葡萄糖的生產(chǎn)方法，其特征在于，在含有淀粉的纖維素系生物 質(zhì)的存在下，使葡萄糖苷酶、α-淀粉酶和葡糖淀粉酶共存來培養(yǎng)嗜熱厭氣性微生物。
[0028] 發(fā)明效果
[0029] 通過本發(fā)明的葡萄糖的生產(chǎn)方法，能夠省略培養(yǎng)嗜熱厭氣性微生物以獲得含有糖 酵解酶的培養(yǎng)液和酶溶液的步驟。
[0030] 特別是，在使用了嗜熱厭氣性微生物的情況下，可將培養(yǎng)條件設(shè)為高的溫度條件， 因而微生物的污染少，可防止含有葡萄糖的培養(yǎng)基的腐敗。
【附圖說明】
[0031] 圖1是表示實(shí)施例1的在具有糖類分解能力的嗜熱厭氣性微生物的培養(yǎng)時(shí)不添加 β-葡萄糖苷酶的情況下的纖維素的分解效率的曲線圖。
[0032] 圖2是表示實(shí)施例1的在具有糖類分解能力的嗜熱厭氣性微生物的培養(yǎng)時(shí)添加了 葡萄糖苷酶的情況下的纖維素的分解效率的曲線圖。
[0033] 圖3是表示實(shí)施例2的在具有糖類分解能力的嗜熱厭氣性微生物的培養(yǎng)時(shí)不添加 葡萄糖苷酶的情況下的纖維素的分解效率的曲線圖。
[0034] 圖4是表示實(shí)施例2的在具有糖類分解能力的嗜熱厭氣性微生物的培養(yǎng)時(shí)添加了 葡萄糖苷酶的情況下的纖維素的分解效率的曲線圖。
[0035] 圖5是表示實(shí)施例3的在具有糖類分解能力的嗜熱厭氣性微生物的培養(yǎng)時(shí)添加了 β-葡萄糖苷酶的情況下的氨水浸漬稻梗的分解能力和葡萄糖蓄積量的曲線圖。
[0036] 圖6是表示實(shí)施例3的在具有糖類分解能力的嗜熱厭氣性微生物的培養(yǎng)時(shí)添加了 葡萄糖苷酶的情況下的杉木漿的分解能力和葡萄糖蓄積量的曲線圖。
[0037] 圖7是表示實(shí)施例4的在具有糖類分解能力的嗜熱厭氣性微生物的培養(yǎng)時(shí)添加了 表面活性劑等的情況下的通過水熱前處理稻梗分解而得到的葡萄糖蓄積量的曲線圖。
[0038] 圖8是表示實(shí)施例6的在具有糖類分解能力的嗜熱厭氣性微生物的培養(yǎng)時(shí)添加了 β -葡萄糖苷酶、α -淀粉酶、葡糖淀粉酶的情況下的木薯漿的葡萄糖生產(chǎn)的曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 以下，一邊參照實(shí)施例一邊詳細(xì)地說明本發(fā)明。
[0040] 本發(fā)明的葡萄糖的制造方法的特征在于，將嗜熱厭氣性微生物在纖維素和葡 萄糖苷酶的存在下培養(yǎng)。
[0041] 嗜熱厭氣性微生物是厭氣性的微生物，是最適生長溫度為50°C以上的微生物，優(yōu) 選為產(chǎn)生將纖維素分解為纖維寡糖和/或單糖類的糖酵解酶的嗜熱厭氣性微生物。已知 通常而言，產(chǎn)生糖酵解酶的嗜熱厭氣性微生物利用通過糖類分解產(chǎn)生的纖維寡糖來進(jìn)行生 長，但對作為單糖的葡萄糖，具有弱的利用性。即，嗜熱厭氣性微生物是產(chǎn)生糖酵解酶的微 生物，更優(yōu)選為具有弱的葡萄糖利用性的微生物，進(jìn)一步優(yōu)選為葡萄糖的攝入速度遲緩的 微生物。
[0042] 以下，將產(chǎn)生糖酵解酶的嗜熱厭氣性微生物稱為具有糖類分解能力的嗜熱厭氣 性微生物D作為這樣的微生物，例如可列舉出熱纖梭菌（Clostridium thermocellum)、 類堆梭菌（Clostridium stercorarium)、熱解糖梭菌（Clostridium thermolacticum)、 解糖熱解纖維素菌（Caldicellulosiruptor saccharolyticus)、貝茜熱解纖維素菌 (Caldicellulosiruptor bescii)、奧布斯底安斯熱解纖維素菌（Caldicellulosiruptor obsidiansis)、解纖維素嗜熱厭氧桿菌（Thermoanaerobacter cellulolyticus)、嗜熱厭氣 菌（Anaerocellum thermophilum)、嗜熱螺旋菌（Spirochaeta thermophila)、海棲熱袍菌 (Thermotoga maritima)、新阿波羅棲熱袍菌（Thermotoga neapolitana)、岸生閃爍桿菌 (Fervidobacterium riparium)、海島閃爍桿菌（Fervidobacterium islandicum) 〇
[0043] 具有糖酵解酶分解能力的嗜熱厭氣性微生物優(yōu)選為產(chǎn)生纖維體的微生物。作為這 樣的微生物，可列舉熱纖梭菌（Clostridium thermocellum)。
[0044] β -葡萄糖苷酶是將糖的β -糖苷鍵分解的酶，優(yōu)選選擇最適反應(yīng)溫度與具有糖 類分解能力的嗜熱厭氣性微生物的最適生長溫度范圍一致的耐熱性的酶。通過將嗜熱厭氣 性微生物與耐熱性的β -葡萄糖苷酶組合，能夠在培養(yǎng)中防止其它種類微生物的污染。
[0045] β-葡萄糖苷酶是最適反應(yīng)溫度為45°C以上且70°C以下、優(yōu)選為50°C以上且70°C 以下的具有耐熱性的酶，優(yōu)選使用來自嗜熱性微生物的