低密度脂蛋白以外的脂蛋白中的甘油三酯的除去方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及樣品中的低密度脂蛋白以外的脂蛋白中的甘油三酯的除去方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 血清、血漿中的脂質(zhì)的主要成分是膽固醇、甘油三酯、磷脂等，這些血中脂質(zhì)與脫 輔基蛋白結(jié)合，作為脂蛋白在血液中循環(huán)。根據(jù)這些脂蛋白的密度差，將它們分為乳糜微 粒（以下稱作CM)、超低密度脂蛋白（以下稱作VLDL)、中密度脂蛋白（以下稱作IDDJS 密度脂蛋白（以下稱作LDL)、高密度脂蛋白（以下稱作HDL)等。在這些脂蛋白中，HDL具 有向肝臟搬運(yùn)沉積在組織中的過剩的膽固醇的作用，具有抗動(dòng)脈硬化作用。另外，LDL是膽 固醇從肝臟到各組織的主要搬運(yùn)體，認(rèn)為LDL的增加與動(dòng)脈硬化的發(fā)生密切相關(guān)。由此認(rèn) 為：LDL中的膽固醇（以下稱作LDL-C)是動(dòng)脈硬化、缺血性心臟疾病（冠狀動(dòng)脈疾?。┑鹊?危險(xiǎn)因子，了解LDL-C的含量，這在上述疾病的診斷、治療和預(yù)防中被當(dāng)作重要的指標(biāo)。另 一方面，還確認(rèn)到了許多即使血液中的LDL-C處于正常范圍也發(fā)生缺血性心臟疾病等的病 例，最近，人們開始關(guān)注LDL顆粒的質(zhì)的變化或膽固醇以外的構(gòu)成成分。
[0003] 據(jù)報(bào)道，含有大量甘油三酯的LDL(以下稱作富含TG的LDL)與膽固醇的含量高的 正常LDL是性狀不同的脂蛋白，其在肝病患者血液中多見，隨著肝病的進(jìn)行，其在血液中的 濃度增加，在肝病末期占血液中所存在的脂蛋白的大部分。另外，富含TG的LDL將巨噬細(xì) 胞泡沫化，根據(jù)由該富含TG的LDL引起的巨噬細(xì)胞泡沫化率與作為氧化LDL之一的丙二醛 修飾LDL的血清中濃度成正比、以及在健康人血液中幾乎檢測(cè)不到過氧化甘油三酯而在肝 病患者血液中發(fā)現(xiàn)過氧化甘油三酯顯著增加等報(bào)道，認(rèn)為LDL中的甘油三酯與氧化LDL密 切相關(guān)。即，認(rèn)為LDL中的甘油三酯量是與肝病、或氧化LDL參與的各種動(dòng)脈硬化、冠狀動(dòng) 脈疾病等有關(guān)的重要指標(biāo)。
[0004] 作為LDL中的甘油三酯（以下稱作LDL-TG)的定量方法，有將分餾分離和甘油三 酯定量這兩個(gè)階段的操作組合來進(jìn)行計(jì)算的方法。分餾分離操作有采用超離心法、電泳法、 高效液相色譜法（HPLC)的方法等，作為定量方法，例如有使用臨床檢查時(shí)使用的自動(dòng)分析 裝置，通過甘油三酯測(cè)定用試劑進(jìn)行定量的方法等。雖然將這兩者組合可以進(jìn)行LDL-TG的 定量，但這些方法是按照完全分離LDL和LDL以外的脂蛋白的前處理步驟和進(jìn)行測(cè)定的步 驟這兩個(gè)階段來進(jìn)行的，所以操作繁雜，耗費(fèi)時(shí)間。另外，根據(jù)分離方法，已分離的樣品本身 難以回收、或者難以定量地回收、或者即使是可以定量地回收的方法也要求操作熟練、或者 需要特別的儀器。這些方法的費(fèi)用也高，在簡(jiǎn)便性或經(jīng)濟(jì)性方面難以普及。
[0005] 在解決這些問題的方法中，作為不用進(jìn)行分餾操作使用自動(dòng)分析裝置等即可以進(jìn) 行測(cè)定的方法，已知有下述方法：通過第1步驟除去LDL以外的所有脂蛋白中的甘油三酯 后，通過第2步驟測(cè)定殘留的LDL中的甘油三酯的方法（專利文獻(xiàn)1);或者通過第1步驟 除去（游離型甘油和）HDL中的甘油三酯后，通過第2步驟只測(cè)定LDL中的甘油三酯的方法 (專利文獻(xiàn)2)。
[0006] 但是，在VLDL中的甘油三酯或CM中的甘油三酯高的樣本中，有時(shí)甘油三酯通過 第1步驟沒有除凈而在第2步驟中留待繼續(xù)完成反應(yīng)，使這些方法受到正面影響（正ω影 響）?；蛘?，在第2步驟中反應(yīng)應(yīng)該受到抑制的VLDL中甘油三酯有時(shí)沒有完全被抑制而是 部分促進(jìn)反應(yīng)，由此使這些方法受到正面影響（正Φ影響）。實(shí)際上，通過多個(gè)樣本比較這 些方法和作為基準(zhǔn)法的超離心法時(shí)，雖然判斷具有正相關(guān)性，但卻發(fā)現(xiàn)了大幅背離的樣本， 或者判斷為偏差大等在對(duì)于樣本的特異性、精密性方面存在大的問題。
[0007] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn) 專利文獻(xiàn) 專利文獻(xiàn)1 :日本特開2006-180707號(hào)公報(bào)； 專利文獻(xiàn)2 :日本再公表2000-043537號(hào)公報(bào)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 發(fā)明所要解決的課題 由此可知：為了能夠提供不用進(jìn)行離心分離、電泳等繁雜的前處理操作，而是直接使 用自動(dòng)分析裝置等對(duì)樣品進(jìn)行簡(jiǎn)便性、特異性、精密性優(yōu)異的LDL-TG的分別定量測(cè)定的方 法，本發(fā)明所要解決的課題在于提供選擇性地除去低密度脂蛋白以外的脂蛋白中的甘油三 酯的方法。
[0009] 用于解決課題的手段 本申請(qǐng)發(fā)明人發(fā)現(xiàn)：通過將某種表面活性劑和脂蛋白脂肪酶組合與樣品發(fā)生作用，與 樣品中的LDL以外的脂蛋白即CM、VLDL、IDUHDL中的甘油三酯發(fā)生一些反應(yīng)而解體，這些 脂蛋白中的甘油三酯被分解。本發(fā)明人認(rèn)為：通過進(jìn)一步提高選擇性、特異性將LDL以外的 脂蛋白中的甘油三酯分解至極限，并在后續(xù)步驟中添加與殘留的LDL反應(yīng)的表面活性劑使 LDL解體，利用脂蛋白脂肪酶的作用分解LDL中的甘油三醋，再定量所生成的過氧化氫，從 而能夠定量LDL中的甘油三酯。于是，進(jìn)一步進(jìn)行研宄發(fā)現(xiàn)了：通過加入膽固醇酯酶，極具 選擇性、特異性地將樣品中的CM、VLDL、IDL、HDL解體，可以分解這些LDL以外的脂蛋白分 餾中的甘油三酯。在其中加入除去過氧化氫的反應(yīng)系統(tǒng)，以抑制在后續(xù)步驟中檢測(cè)到反應(yīng) 的結(jié)果產(chǎn)生的甘油三酯的分解產(chǎn)物即過氧化氫，從而成功地選擇性地除去了低密度脂蛋白 以外的脂蛋白中的甘油三醋，完成了本發(fā)明。
[0010] 即，本發(fā)明提供低密度脂蛋白以外的脂蛋白中的甘油三酯的除去方法，該方法包 括：在與低密度脂蛋白以外的脂蛋白發(fā)生作用的表面活性劑或具有LDL保護(hù)作用的表面活 性劑的存在下，使脂蛋白脂肪酶、膽固醇酯酶、甘油激酶和甘油-3-磷酸氧化酶與樣品發(fā)生 作用，除去所產(chǎn)生的過氧化氫。
[0011] 發(fā)明效果 根據(jù)本發(fā)明的方法，不用進(jìn)行離心操作等繁雜的處理，即可簡(jiǎn)便地除去LDL以外的脂 蛋白中的甘油三酯。
【附圖說明】
[0012] 圖1是顯示通過超離心法得到的LDL中的甘油三酯的定量值與通過下述比較例2 的方法得到的LDL中的甘油三酯的定量值的相關(guān)關(guān)系的圖； 圖2是顯示通過超離心法得到的LDL中的甘油三酯的定量值與通過下述實(shí)施例5的方 法得到的LDL中的甘油三酯的定量值的相關(guān)關(guān)系的圖； 圖3是顯示通過超離心法得到的LDL中的甘油三酯的定量值與通過下述實(shí)施例6的方 法得到的LDL中的甘油三酯的定量值的相關(guān)關(guān)系的圖； 圖4是顯示通過超離心法得到的LDL中的甘油三酯的定量值與通過下述實(shí)施例7的方 法得到的LDL中的甘油三酯的定量值的相關(guān)關(guān)系的圖； 圖5是顯示通過超離心法得到的LDL中的甘油三酯的定量值與通過下述比較例3的方 法得到的LDL中的甘油三酯的定量值的相關(guān)關(guān)系的圖； 圖6是顯示通過超離心法得到的LDL中的甘油三酯的定量值與通過下述實(shí)施例8的方 法得到的LDL中的甘油三酯的定量值的相關(guān)關(guān)系的圖； 圖7是顯示通過超離心法得到的LDL中的甘油三酯的定量值與通過下述實(shí)施例9的方 法得到的LDL中的甘油三酯的定量值的相關(guān)關(guān)系的圖； 圖8是顯示通過超離心法得到的LDL中的甘油三酯的定量值與通過下述實(shí)施例10的 方法得到的LDL中的甘油三酯的定量值的相關(guān)關(guān)系的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 本發(fā)明的方法是通過下述方法除去樣品中的LDL以外的脂蛋白中的甘油三酯。 LDL以外的脂蛋白有CM、VLDL、IDL和HDL。由于CM、VLDL、IDL和HDL中的甘油三酯被除去， 所以通過后續(xù)步驟分解脂蛋白并定量甘油三酯時(shí)，該甘油三酯主要是樣品中的LDL中的甘 油三酯。
[0014] 作為用于本發(fā)明的方法的樣品，只要是可能含有CM、VLDL、IDULDL和HDL等脂蛋 白的樣品則均可使用，例如可以列舉血液、血清、血漿等體液或其稀釋物，但并不限于這些。
[0015] 本發(fā)明中的上述"除去甘油三酯"是指，分解甘油三酯，并且在后續(xù)步驟中檢測(cè)不 到其分解產(chǎn)物。作為選擇性地除去LDL以外的脂蛋白、即CM、VLDL、IDL和HDL等中所含的 甘油三酯的方法，通過下述方法來進(jìn)行。
[0016] S卩，在與LDL以外的脂蛋白發(fā)生作用的表面活性劑、或具有LDL保護(hù)作用的表面活 性劑的存在下，使脂蛋白脂肪酶、膽固醇酯酶、甘油激酶和甘油-3-磷酸氧化酶發(fā)生作用， 除去生成的過氧化氫。
[0017] 作為除去過氧化氫的方法，可以列舉：與過氧化氫酶發(fā)生作用以分解成水和氧的 方法；以及使用過氧化物酶使酚系或苯胺系供氫體化合物與過氧化氫反應(yīng)而轉(zhuǎn)化成無色醌 的方法，可以采用任一種方法，而且不限于這些方法。上述過氧化氫的除去方法本身在本領(lǐng) 域眾所周知。
[0018] 反應(yīng)液中的脂蛋白脂肪酶濃度優(yōu)選0.01?2000KU/L左右，進(jìn)一步優(yōu)選0.05? 1000KU/L左右。甘油激酶的濃度優(yōu)選0. 02?80. 0KU/L左右，進(jìn)一步優(yōu)選0. 05?40. 0KU/L 左右。甘油-3-磷酸氧化酶的濃度優(yōu)選0. 2?20. 0KU/L左右，進(jìn)一步