遺傳變體的基于多重的順序連接的檢測(cè)的制作方法
【專利說(shuō)明】遺傳變體的基于多重的順序連接的檢測(cè) 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及目的核酸區(qū)域的基于多重的順序連接的分析（multiplexed sequential ligation-based analysis)的方法。
[0002] 相關(guān)申請(qǐng)
[0003] 本申請(qǐng)要求2012年7月19日提交的USSN 61/673, 337和2012年10月1號(hào)提交 的USSN 61/708, 334的優(yōu)先權(quán)。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 在以下討論中，將為了背景和介紹目的描述特定文章和方法。在此包含的任何內(nèi) 容不得解釋為現(xiàn)有技術(shù)的"承認(rèn)"。申請(qǐng)人明確地保留在適合情況下解釋，在此引用的文章 和方法在適用法定條款下不構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)的權(quán)利。
[0006] 遺傳異常導(dǎo)致了寬范圍病理，包括由染色體非整倍性引起的綜合征（例如，唐氏 綜合征）和由導(dǎo)致單基因或多基因疾病或紊亂的生殖系突變引起的那些。用于確定遺傳異 常的診斷方法已經(jīng)成為用于鑒定具體的綜合征、疾病和紊亂的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。特別地，產(chǎn)前診斷 已經(jīng)成為了在高危群體中確定特定的紊亂的存在或不存在的標(biāo)準(zhǔn)慣例。總?cè)旧w異常，例 如三體、易位和大的插入或缺失，和單基因特性，例如單基因突變或與Rh血型態(tài)相關(guān)的多 態(tài)性、常染色體顯性或X連鎖紊亂、或常染色體隱性紊亂兩者的檢測(cè)在檢測(cè)可影響胎兒的 實(shí)際和潛在病癥和紊亂中都是有用的。例如，染色體異常諸如13、18和21三體，與唐氏綜合 征和其他綜合征的某些形式相關(guān)的羅伯遜易位，和大缺失諸如在迪喬治綜合征（DiGeorge syndrome)中染色體22上發(fā)現(xiàn)的那些都顯著地影響胎兒健康。
[0007] 類似地，在胎兒中單基因紊亂，例如引起泰-薩二氏病（Tay-Sachs disease)、鐮 狀細(xì)胞貧血、和地中海貧血的基因上突變或例如脊髓性肌萎縮（SMA)的疾病中拷貝數(shù)變體 的檢測(cè)，可輔助家長(zhǎng)做出關(guān)于兒童的健康和照顧的重要決定。另外，與血型系統(tǒng)狀態(tài)相關(guān)的 基因狀態(tài)提供了用于母親和/或胎兒健康的重要信息，且在許多情況下，此知識(shí)提供了懷 孕中或出生后立即用于干預(yù)以預(yù)防任何有害結(jié)果的機(jī)會(huì)。
[0008] 盡管常規(guī)技術(shù)提供用于這些不同遺傳異常的檢測(cè)方法，目前需要不同技術(shù)以詢 問(wèn)突變的不同類型。目前，用于染色體非整倍性的產(chǎn)前診斷測(cè)試的常規(guī)方法需要使用妊 娠第11和14周之間的絨毛膜絨毛取樣（CVS)或第15周后羊膜穿刺，直接從子宮移出胎 兒細(xì)胞的樣品用于基因分析。然而，這些侵入性程序攜帶約百分之一的流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)（參見(jiàn) Mujezinovic 和 Alf irevic, Obstet. Gynecol.，110:687-694 (2011))。胎兒細(xì)胞的目前分析 典型地涉及核型分析或熒光原位（in situ)雜交法（FISH)且不提供關(guān)于單基因特性的信 息；因此，需要另外測(cè)試用于單基因疾病和紊亂的鑒定。因此，期望關(guān)于其胎兒狀態(tài)的基因 信息的母親必須經(jīng)受多次測(cè)試以測(cè)試各種遺傳異常。
[0009] 在母親樣本中提供非多態(tài)性因素例如基因拷貝數(shù)變異的精確定量以及遺傳多態(tài) 性或突變的同時(shí)鑒定的方法，將是鑒定例如在母親和其胎兒中潛在醫(yī)療并發(fā)癥的強(qiáng)大工 具?？蛇x地或另外，本發(fā)明的方法可應(yīng)用于混合的樣品例如包含宿主/病原體或宿主/移 植物核酸的那些。本發(fā)明解決了該需求。
[0010] 發(fā)明概述
[0011] 提供了該概述以用簡(jiǎn)化的形式引入還描述于以下詳述中的概念的選集。該概述 不是旨在標(biāo)示要求保護(hù)的主題的關(guān)鍵或基本特征，也不旨在用于限制要求保護(hù)的主題的范 圍。從包括在附圖中闡明并在所附權(quán)利要求中限定的那些方面的以下書面的詳述中，要求 保護(hù)的主題的其他特征、詳細(xì)說(shuō)明、用途和優(yōu)勢(shì)將變得明顯。
[0012] 本發(fā)明提供了用于遺傳變異的基于多重的順序連接的分析的改進(jìn)的方法和系統(tǒng)。 本發(fā)明的方法允許從染色體和/或參考染色體擴(kuò)增目的區(qū)域以檢測(cè)染色體異常例如非整 倍性、大插入或缺失、和來(lái)自相同或不同目的區(qū)域的多態(tài)性?？蛇x地或另外，本發(fā)明的方法 可應(yīng)用于混合的樣品例如包含宿主/病原體或宿主/移植物核酸的那些。本發(fā)明的方法利 用了在相同基因座或目的區(qū)域中起始組寡核苷酸探針和至少一個(gè)后續(xù)組寡核苷酸探針的 順序雜交、延伸（任選的）、連接和擴(kuò)增反應(yīng)。用兩組寡核苷酸探針以順序方式使用這些方 法允許從每個(gè)目的區(qū)域獲得的遺傳信息的精度上提高的保真度和置信度。
[0013] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了鑒定在包含來(lái)自兩種不同來(lái)源的DNA樣品中來(lái) 自單一來(lái)源的目的基因組區(qū)域的方法，包含步驟：提供包含來(lái)自兩種不同來(lái)源的DNA的樣 品；向樣品引入包含與目的基因組區(qū)域中的3'區(qū)域互補(bǔ)的第一固定序列寡核苷酸和與目 的基因組區(qū)域中的5'區(qū)域互補(bǔ)的第二固定序列寡核苷酸的第一組寡核苷酸探針；將第一 組寡核苷酸探針與樣品中的目的基因組區(qū)域雜交；連接第一組寡核苷酸探針的雜交的寡核 苷酸以創(chuàng)建與目的基因組區(qū)域互補(bǔ)的第一連接產(chǎn)物；向第一連接產(chǎn)物引入包含與第一連接 產(chǎn)物中的3'區(qū)域互補(bǔ)的第一固定序列寡核苷酸和與第一連接產(chǎn)物中的5'區(qū)域互補(bǔ)的第二 固定序列寡核苷酸的第二組寡核苷酸探針；將第二組寡核苷酸探針與第一連接產(chǎn)物雜交； 連接第二組寡核苷酸探針的雜交的寡核苷酸以創(chuàng)建與第一連接產(chǎn)物互補(bǔ)的第二連接產(chǎn)物； 擴(kuò)增第二連接產(chǎn)物以創(chuàng)建擴(kuò)增產(chǎn)物；以及分析擴(kuò)增產(chǎn)物，其中擴(kuò)增產(chǎn)物的分析鑒定樣品中 來(lái)自單一來(lái)源的目的基因組區(qū)域。
[0014] 在該實(shí)施方案的一些方面，第一組寡核苷酸探針還包含在第一組寡核苷酸的第一 和第二固定序列寡核苷酸之間或與其毗連地與目的基因組區(qū)域雜交的一個(gè)或更多個(gè)橋接 寡核苷酸，且在相同或其他方面，第二組還包含在第二組寡核苷酸探針的第一和第二固定 序列寡核苷酸之間或與其毗連地與第一連接產(chǎn)物雜交的一個(gè)或更多個(gè)橋接寡核苷酸。
[0015] 在該實(shí)施方案的其他方面，第一組寡核苷酸探針和/或第二組寡核苷酸探針的寡 核苷酸與在目的基因組區(qū)域中的非毗連區(qū)域互補(bǔ)，且在第一和/或第二組的第一固定序列 寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸之間的區(qū)域用聚合酶和dNTP延伸以創(chuàng)建連續(xù)地互補(bǔ)的 寡核苷酸。在一個(gè)可選的方面，第一組和/或第二組寡核苷酸探針的固定序列寡核苷酸與 目的基因組區(qū)域中的毗連區(qū)域互補(bǔ)。
[0016] 在該實(shí)施方案的一些方面，第二組寡核苷酸探針的至少一個(gè)固定序列寡核苷酸包 含與第一連接產(chǎn)物的連接接點(diǎn)重疊的互補(bǔ)區(qū)域，且在其他方面，第二組寡核苷酸探針的第 一和第二固定序列寡核苷酸兩者都包含與第一連接產(chǎn)物的連接接點(diǎn)重疊的互補(bǔ)區(qū)域。在又 其他方面，第二組寡核苷酸探針的至少一個(gè)固定序列寡核苷酸包含與目的基因組區(qū)域互補(bǔ) 的第一組寡核苷酸探針的固定序列寡核苷酸的區(qū)域，且在其他方面，第二組寡核苷酸探針 的兩個(gè)固定序列寡核苷酸都包含與目的基因組區(qū)域互補(bǔ)的固定序列寡核苷酸的區(qū)域。
[0017] 本發(fā)明的其他實(shí)施方案提供了用于鑒定在包含來(lái)自兩種不同來(lái)源的DNA的樣品 中來(lái)自單一來(lái)源的目的基因組區(qū)域的方法，包含步驟：提供包含來(lái)自兩種不同來(lái)源的DNA 的樣品；向樣品引入包含與目的基因組區(qū)域中的3'區(qū)域互補(bǔ)的第一固定序列寡核苷酸和 與目的基因組區(qū)域中的5'區(qū)域互補(bǔ)的第二固定序列寡核苷酸的第一組寡核苷酸探針，和 在第一組寡核苷酸探針的第一和第二固定序列寡核苷酸之間或與其毗連地與目的基因組 區(qū)域雜交的一個(gè)或更多個(gè)橋接寡核苷酸；將第一組寡核苷酸探針與樣品中目的基因組區(qū)域 雜交；連接第一組寡核苷酸探針的雜交的寡核苷酸以創(chuàng)建與目的基因組區(qū)域互補(bǔ)的第一 連接產(chǎn)物；向第一連接產(chǎn)物引入包含與第一連接產(chǎn)物中的3'區(qū)域互補(bǔ)的第一固定序列寡 核苷酸和與第一連接產(chǎn)物中的5'區(qū)域互補(bǔ)的第二固定序列寡核苷酸的第二組寡核苷酸探 針，和在第二組寡核苷酸探針的第一和第二固定序列寡核苷酸之間或與其毗連地與第一連 接產(chǎn)物雜交的一個(gè)或更多個(gè)橋接寡核苷酸；將第二組寡核苷酸探針與第一連接產(chǎn)物雜交； 連接第二組的雜交的寡核苷酸以創(chuàng)建與第一連接產(chǎn)物互補(bǔ)的第二連接產(chǎn)物；擴(kuò)增第二連接 產(chǎn)物以創(chuàng)建擴(kuò)增產(chǎn)物；以及分析產(chǎn)物，其中擴(kuò)增產(chǎn)物的分析鑒定了樣品中來(lái)自單一來(lái)源的 目的基因組區(qū)域。
[0018] 本發(fā)明的其他實(shí)施方案還提供了用于鑒定在包含來(lái)自兩種不同來(lái)源的DNA的樣 品中來(lái)自單一來(lái)源的目的基因組區(qū)域的方法，包含步驟：提供包含來(lái)自兩種不同來(lái)源的 DNA的樣品；向樣品引入包含與目的基因組區(qū)域中的3'區(qū)域互補(bǔ)的第一固定序列寡核苷酸 和與目的基因組區(qū)域中的5'區(qū)域互補(bǔ)的第二固定序列寡核苷酸的第一組寡核苷酸探針， 其中第一和第二固定序列寡核苷酸與目的基因組區(qū)域中的非毗連區(qū)域互補(bǔ)；將第一組寡核 苷酸探針與樣品中目的基因組區(qū)域雜交；用聚合酶和dNTP延伸第一組寡核苷酸探針的第 一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸之間的區(qū)域以創(chuàng)建與目的基因組區(qū)域互補(bǔ) 的第一組寡核苷酸探針的連續(xù)地雜交的寡核苷酸；連接第一組寡核苷酸探針的連續(xù)地雜交 的寡核苷酸以創(chuàng)建與目的基因組區(qū)域互補(bǔ)的第一連接產(chǎn)物；向第一連接產(chǎn)物引入包含與第 一連接產(chǎn)物中的3'區(qū)域互補(bǔ)的第一固定序列寡核苷酸和與第一連接產(chǎn)物中的5'區(qū)域互補(bǔ) 的第二固定序列寡核苷酸的第二組寡核苷酸探針，其中第一和第二固定序列寡核苷酸與第 一連接產(chǎn)物中的非毗連區(qū)域互補(bǔ)；將第二組寡核苷酸探針雜交到第一連接產(chǎn)物；用聚合酶 和dNTP延伸第二組的第一固定序列寡核苷酸和第二固定序列寡核苷酸之間的區(qū)域以創(chuàng)建 與第一連接產(chǎn)物互補(bǔ)的第二組寡核苷酸探針的連續(xù)地雜交的寡核苷酸；連接第二組寡核苷 酸探針的連續(xù)地雜交的寡核苷酸以創(chuàng)建與第一連接產(chǎn)物互補(bǔ)的第二連接產(chǎn)物；擴(kuò)增第二連 接產(chǎn)物以創(chuàng)建擴(kuò)增產(chǎn)物；并分析擴(kuò)增產(chǎn)物，其中擴(kuò)增產(chǎn)物的分析鑒定了樣品中來(lái)自單一來(lái) 源的目的基因組的區(qū)域。
[0019] 其他實(shí)施方案還提供了用于鑒定在一個(gè)或更多個(gè)目的基因組區(qū)域中的遺傳變異 的方法，包含步驟：提供包含來(lái)自兩種或更多種來(lái)源的核酸的樣品中的至少一個(gè)目的區(qū)域 的核酸；導(dǎo)入包含在目的區(qū)域中的5'處退火的第一固定序列寡核苷酸探針、在目的區(qū)域中 的3'處退火的第二固定序列寡核苷酸探針、和在第一和第二固定寡核苷酸探針之間退火 的橋接寡核苷酸探針的至少一個(gè)起始組的寡核苷酸探針；如果其與橋接寡核苷酸探針不連 續(xù)地雜交，則延伸第一固定序列寡核苷酸探針；如果其與第二固定寡核苷酸探針不連續(xù)地 雜交，則延伸橋接寡核苷酸探針；連接來(lái)自起始組寡核苷酸探針的雜交的寡核苷酸探針以 創(chuàng)建與目的區(qū)域互補(bǔ)的第一連接產(chǎn)物；引入包含在第一連接產(chǎn)物中的5'處退火的第一固 定序列寡核苷酸探針、在第一連接產(chǎn)物中3'處退火的第二固定序列寡核苷酸探針、和在第 一連接產(chǎn)物中的第一和第二固定寡核苷酸探針之間退火的橋接至少一個(gè)后續(xù)組寡核苷酸 探針的寡核苷酸探針；如果其不與后續(xù)組寡核苷酸探針的橋接寡核苷酸探針連續(xù)地雜交， 則延伸后續(xù)組寡核苷酸探針的第一固定序列寡核苷酸探針；如果其與后續(xù)組寡核苷酸探針 的第二固定序列寡核苷酸探針不連續(xù)地雜交，則延伸后續(xù)組寡核苷酸探針的橋接寡核苷酸 探針；連接來(lái)自第二組寡核苷酸探針中的雜交的寡核苷酸探針以創(chuàng)建與第一連接產(chǎn)物互補(bǔ) 的第二連接產(chǎn)物；擴(kuò)增第二連接產(chǎn)物；并分析擴(kuò)增產(chǎn)物，其中擴(kuò)增產(chǎn)物的分析鑒定了在一 個(gè)或更多個(gè)目的區(qū)域中的遺傳變異。在一些方面，起始組寡核苷酸探針的橋接寡核苷酸與 起始組寡核苷酸探針的第一和第二固定寡核苷酸探針立即連續(xù)地以及在其間雜交，且在一 些方面，在雜交之后使用dNTP和DNA聚合酶延伸起始組寡核苷酸探針的第一固定序列寡核 苷酸和橋接寡核苷酸的一個(gè)或兩個(gè)，以提供在起始組寡核苷酸探針中連續(xù)地雜交的固定寡 核苷酸探針和橋接寡核苷酸探針。在一些方面，后續(xù)組寡核苷酸探針的橋接寡核苷酸與后 續(xù)組寡核苷酸探針的第一和第二固定寡核苷酸探針立即連續(xù)地以及在其間雜交，且在一些 方面，在雜交之后使用dNTP和DNA聚合酶延伸后續(xù)組寡核苷酸探針的第一固定序列寡核苷 酸和橋接寡核苷酸的一個(gè)或兩個(gè)，以提供在后續(xù)組寡核苷酸探針中連續(xù)地雜交的固定寡核 苷酸探針和橋接寡核苷酸探針。
[0020] 在又其他實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了用于鑒定在一個(gè)或更多個(gè)目的基因組區(qū)域 中的遺傳變體的方法，包含步驟：提供包含來(lái)自樣品的至少一個(gè)目的區(qū)域的DNA，所述樣品 包含來(lái)自兩種或更多種來(lái)源的DNA ;引入包含在目的區(qū)域的5'處退火的第一固定序列寡核 苷酸探針、在目的區(qū)域3'處退火的第二固定序列寡核苷酸探針的至少一個(gè)起始組的寡核 苷酸探針；如果其不連續(xù)地雜交，則用聚合酶和dNTP延伸在起始組的第一固定序列寡核苷 酸探針和第二固定序列寡核苷酸探針之間的區(qū)域以從起始組中創(chuàng)建連續(xù)地雜交的寡核苷 酸探針；用相應(yīng)于起始組的第一固定序列寡核苷酸探針之間的連接位點(diǎn)的連接接點(diǎn)，連接 來(lái)自起始組寡核苷酸探針中的連續(xù)地雜交的寡核苷酸探針以創(chuàng)建與目的區(qū)域互補(bǔ)的第一 連接產(chǎn)物；引入包含在第一連接產(chǎn)物中的5'處退火的第一固定序列寡核苷酸探針、在第一 連接產(chǎn)物中的3'處退火的第二固定序列至少一個(gè)后續(xù)組寡核苷酸探針的寡核苷酸探針， 其中第一和第二固定序列核苷酸探針被一個(gè)或更多個(gè)堿基隔開(kāi)；如果其不連續(xù)地雜交，則 用聚合酶和dNTP延伸后續(xù)組的第一固定序列寡核苷酸探針和第二固定序列寡核苷酸探針 之間的區(qū)域，以創(chuàng)建連續(xù)地雜交的寡核苷酸后續(xù)探針；用相應(yīng)于在后續(xù)組寡核苷酸探針的 第一固定序列寡核苷酸探針和第二固定序列寡核苷酸探針之間的連接位點(diǎn)的第二連接接 點(diǎn)，連接連續(xù)地雜交的后續(xù)寡核苷酸探針以創(chuàng)建與第一連接產(chǎn)物互補(bǔ)的第二連接產(chǎn)物，其 中在第二連接產(chǎn)物中第一和第二連接接點(diǎn)相對(duì)于彼此不同；擴(kuò)增第二連接產(chǎn)物；并分析擴(kuò) 增產(chǎn)物，其中擴(kuò)增產(chǎn)物的分析將鑒定在一個(gè)或更多個(gè)目的基因組區(qū)域中的遺傳變體。在一 些方面，起始組寡核苷酸探針和后續(xù)組寡核苷酸探針的連接接點(diǎn)是相同的，且在一些方面 它們是不同的。
[0021] 在這些實(shí)施方案的一些方面，發(fā)明的方法還包含在第一連接步驟之后和第二引入 步驟之前擴(kuò)增第一連接產(chǎn)物的步驟，其中在一些方面，擴(kuò)增是線性的，且在其他方面擴(kuò)增是 指數(shù)的。
[0022] 在這些實(shí)施方案的大多數(shù)方面，方法是多重的；S卩，在來(lái)自單一來(lái)源的兩個(gè)或更多 個(gè)基因組區(qū)域上進(jìn)行，包含來(lái)自單一來(lái)源的至少24個(gè)、48個(gè)、92個(gè)、180個(gè)、360個(gè)、500個(gè)或 更多個(gè)目的基因組區(qū)域。
[0023] 在這些實(shí)施方案的一些方面，后續(xù)或第二連接產(chǎn)物通過(guò)線性擴(kuò)增方法來(lái)擴(kuò)增，且 在其他方面，后續(xù)或第二連接產(chǎn)物通過(guò)指數(shù)擴(kuò)增方法來(lái)擴(kuò)增。
[0024] 在這些實(shí)施方案的一些方面，一個(gè)或更多個(gè)組的寡核苷酸探針的固定序列寡核苷 酸是單分子探針。在一些方面，起始組寡核苷酸探針和后續(xù)組的一個(gè)或兩個(gè)的第一和第二 固定序列寡核苷酸探針在一個(gè)分子中被連接在一起作為預(yù)環(huán)化探針（precircle probe)。
[0025] 如本文所述，將更詳細(xì)地提供這些和其他方面、特征和優(yōu)勢(shì)。
[0026] 附圖簡(jiǎn)述
[0027] 圖IA是本發(fā)明的基于多重的順序連接的分析方法