Vegfr2單鏈抗體與mica融合蛋白的制備方法及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種新的可與人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體 2特異結(jié)合的高親和力的與MICA連接的融合抗體（AK404R-MICA)，可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增 殖、迀移、細(xì)胞侵襲和小管形成，還可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞K562的生長(zhǎng)，是一種具有抗腫瘤 活性的基因工程融合抗體。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤細(xì)胞能夠滲入淋巴管和血管并通過(guò)血流循環(huán)侵入正常的組織中，使癌癥成為 潛在威脅生命的疾病。腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移的一個(gè)必備條件就是血管的新生。然而，新生血管 的形成的關(guān)鍵之一就是血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF)家族和相關(guān)受體，它通過(guò)與血管內(nèi) 皮生長(zhǎng)因子受體（VEGFR)結(jié)合激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、迀移，促進(jìn)新 生血管的生成，與機(jī)體多種常見(jiàn)腫瘤的發(fā)病及腫瘤的轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系。VEGFR-2,在人 體內(nèi)又稱為KDR(KinaseInsertDomainReceptor)，與VEGF具有較高的親和力，它在介導(dǎo) VEGF刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖及血管通透性等生物學(xué)活性中起重要作用。。KDR屬酪氨酸激酶受 體（Receptorprotein-tyrosinekinase)，2?3區(qū)和VEGF的結(jié)合有關(guān)，2和4區(qū)主要影響 其與VEGF的分離，1區(qū)主要負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)受體與配體的結(jié)合，4?7區(qū)中可能存在抑制與VEGF 結(jié)合的位點(diǎn)，其中3區(qū)（即KDR3,含有97個(gè)氨基酸）對(duì)VEGF的結(jié)合貢獻(xiàn)最為突出。
[0003]主要組織相容性復(fù)合物工鏈分子A(MajorHistocompatibilityComplexclass I-relatedchainmoleculesA，MICA)，是一種高度糖基化的由MHC基因編碼的跨膜糖蛋 白，在免疫監(jiān)視中起重要作用，MICA為天然殺傷（NK)細(xì)胞活化受體NKG2D的配體，研宄表 明，表達(dá)MICA的腫瘤細(xì)胞普遍對(duì)NK細(xì)胞殺傷較為敏感。自然殺傷細(xì)胞表面受體2D(NKG2D)， 是C型凝集素超家族中的一員，不僅表達(dá)于所有的NK細(xì)胞，且表達(dá)于CD8+T細(xì)胞、活化的巨 噬細(xì)胞表面。NKG2D與其配體的交聯(lián)可觸發(fā)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，在腫瘤免疫監(jiān)視中起著 非常重要的作用，靶細(xì)胞上NKG2D配體的表達(dá)水平幾乎決定了機(jī)體NK細(xì)胞免疫應(yīng)答的強(qiáng) 弱。
[0004] 之前本實(shí)驗(yàn)室利用噬菌體展示技術(shù)獲得了以KDR胞外3區(qū)為抗原的單鏈抗體 AK404R，但是考慮到單鏈抗體的相對(duì)較小的分子量（30KDa)并且缺失Fc片段，我們構(gòu)建表 達(dá)了 一個(gè)融合抗體AK404R-MICA去增強(qiáng)其腫瘤治療的有效性。
[0005] 貝伐單抗（Bevacizumab，商品名Avastin)是目前市場(chǎng)上最常用于針對(duì) VEGF-VEGFR2信號(hào)通路的抗體藥物。是重組的人源化單克隆抗體，2004年獲得FDA的批準(zhǔn)， 是美國(guó)第一個(gè)獲得批準(zhǔn)上市的抑制腫瘤血管生成的藥。通過(guò)體內(nèi)外檢測(cè)系統(tǒng)證實(shí)IgGl抗 體能與人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF)結(jié)合并阻斷其生物活性。而阿瓦斯汀包含了人源抗體 的結(jié)構(gòu)區(qū)和可結(jié)合VEGF的鼠源單抗的互補(bǔ)決定區(qū)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明目的
[0007] 本發(fā)明提供一種具有潛在醫(yī)學(xué)和藥學(xué)價(jià)值的融合抗體AK404R-MICA。本發(fā)明的融 合抗體的特征是VEGFR2的單鏈抗體與MICA連接，在體外能夠抑制人白血病細(xì)胞K562的增 殖。
[0008] 技術(shù)方案
[0009] -種VEGFR2的單鏈抗體與MICA連接融合抗體的制備，其特征在于：
[0010] VEGFR2的單鏈抗體與MICA連接的融合抗體包括以KDR胞外3區(qū)為抗原的單鏈抗 體AK404R和MICA，通過(guò)一個(gè)Linker(G4S)連接。
[0011] -種分離的核酸，其特征在于該核酸編碼上述的抗體。
[0012] 一種表達(dá)載體，含有上述的核酸。
[0013] 一種重組宿主細(xì)胞，含上述的表達(dá)載體。
[0014] 一種畢赤酵母分泌表達(dá)法，用于分泌表達(dá)的融合抗體。
[0015] 上述任一項(xiàng)的融合抗體或融合抗體片段的應(yīng)用，選擇性地與KDR3結(jié)合或NKG2D結(jié) 合。
[0016] 上述任一項(xiàng)的融合抗體片段，選自單鏈抗體、Fab、單鏈Fv、雙抗體和三抗體。
[0017] 上述任一項(xiàng)的融合抗體或融合抗體片段的偶聯(lián)物。
[0018] 所述的偶聯(lián)物，含有抗腫瘤藥物、靶組成部分或報(bào)告組成部分。
[0019] 發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明：
[0020] 本發(fā)明中融合抗體基因序列全長(zhǎng)1596個(gè)核苷酸，其中單鏈抗體735個(gè)核苷酸， MICA828個(gè)核苷酸，通過(guò)一個(gè)Linker(G4S)連接。
[0021] 含有本發(fā)明人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體單鏈抗體基因的表達(dá)載體和宿主菌，MICA基 因的表達(dá)載體和宿主菌以及融合抗體的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。擴(kuò) 增本發(fā)明融合抗體基因的任意片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0022] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種可以表達(dá)和純化上述融合抗體AK404R-MICA的 方法。
[0023] 本發(fā)明通過(guò)一個(gè)G4S連接單鏈抗體和MICA并導(dǎo)入到畢赤酵母中篩選發(fā)酵得到能 特異性結(jié)合KDR3和NKG2D的融合抗體。培養(yǎng)5天后，低溫離心去除細(xì)胞碎片，將上清過(guò)鎳 親和層析柱進(jìn)行分離純化；WesternBlot鑒定分離純化得到的AK404R-MICA;ELISA分析融 合抗體與KDR3和NKG2D的結(jié)合作用；利用表面等離子體共振分析融合蛋白與KDR3和NKG2D 的親和力；檢驗(yàn)融合蛋白對(duì)人白血病細(xì)胞K562的抑制作用。
[0024] 本發(fā)明得到的融合抗體AK404R-MICA與人白血病細(xì)胞K562和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 HUVEC具有高特異性結(jié)合，體外抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明得到的融合抗體可 以明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。本發(fā)明為治療和診斷以人內(nèi)皮血管生長(zhǎng)因子受體的表達(dá)，特 別是過(guò)量表達(dá)為特征的疾病提供了基于抗體的療法，相關(guān)疾病包括但不限于自身免疫病和 癌癥。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1。圖1A是表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。LI:linkerl，L2 :linker2,限制酶切位點(diǎn)：EcoRl 和Xbal。圖1B是MICA和AKA404R的PCR后的產(chǎn)物圖。圖1C是AK404R-MICA經(jīng)PCR后的 產(chǎn)物圖。
[0026] 圖2。圖2A顯示SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳圖，描述發(fā)酵表達(dá)的融合抗體通過(guò)鎳柱進(jìn) 行分離純化的結(jié)果，泳道1?9不同濃度咪唑緩沖液洗滌鎳柱結(jié)果，泳道2?9為含lOOmM 咪唑緩沖液洗脫鎳柱獲得的目的蛋白（70KD)圖2B顯示的是融合蛋白的示意圖；圖2C顯示 SDS-PAGE經(jīng)純化復(fù)性后的MICA，泳道1為非還原性MICA，泳道2為還原性MICA。圖2D顯 示SDS-PAGE經(jīng)純化復(fù)性后的NKG2D，泳道1為非還原性NKG2D，泳道2為還原性NKG2D。圖 2E顯示利用WesternBlot融合抗體與重組KDR3的結(jié)合。圖2F顯示利用WesternBlot融 合抗體與重組NKG2D的結(jié)合。
[0027] 圖3。圖3A展示的是等面等離子體共振分析融合抗體與重組NKG2D之間的親和力 常數(shù)，Ka=ka= 6. 77X109/MS，kd= 267. 4/S和KD= 3. 95X1(T8M。圖 3B展示的是等面等 離子體共振分析融合抗體與重組KDR3之間的親和力常數(shù)，Ka= 4. 26X106/MS，kd= 261/S 和KD= 6. 13X10 _7M。圖3C展示的是融合抗體與重組NKG2D的ELISA結(jié)合活性。圖3D展 示的是融合抗體與重組KDR3的ELISA結(jié)合活性。
[0028] 圖4。圖4A、D流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)融合抗體、AK404R與HUVEC細(xì)胞的結(jié)合，結(jié)合率分 別為62. 7%和67. 0%，對(duì)照組MICA和PBS分別為2. 1 %和1. 5%。圖B、D流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 融合抗體、MICA與U937的結(jié)合，結(jié)合率分別為69. 7 %和58. 0 %，對(duì)照組AK404R和PBS與 U937無(wú)顯著性結(jié)合。圖C、D流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)融合抗體、AK404R、MICA和PBS均與HEK293 (人 胚腎細(xì)胞）細(xì)胞無(wú)顯著結(jié)合。
[0029] 圖5。圖5A展示融合抗體對(duì)HUVEC細(xì)胞的抑制作用呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性。 圖5B展示的是融合抗體對(duì)HUVEC細(xì)胞的抑制增殖作用，48小時(shí)的半數(shù)抑制率IC5(I:? 333. 186nM，HEK293作為陰性細(xì)胞。
[0030] 圖6。圖6A展示是Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，融合抗體能夠有效抑制內(nèi)皮細(xì)胞的侵襲。 圖6B定量分析Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，融合抗體能夠以劑量依賴性抑制內(nèi)皮細(xì)胞的侵襲。
[0031] 圖7。圖7A展示K562的細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)，隨著效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞的比例升高而升高。圖 7B展示MDA-MB-435的細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)，隨著效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞的比例升高而升高。圖7C展示的 B16F1細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)，隨著效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞的比例升高而升高。圖7D展示3T3-L1 (control) 的細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)。
[0032] 以下借助非限制性實(shí)施例舉詳細(xì)描述本發(fā)明。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離 本發(fā)明精神的前提下對(duì)它所做的任何顯而易見(jiàn)的改動(dòng)，特別是對(duì)若干部件的等同替換，都 構(gòu)成對(duì)本發(fā)明專利權(quán)的侵犯，將承擔(dān)相應(yīng)的法律責(zé)任。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 實(shí)施例中涉及的百分比，其中固定試劑為重量體積百分比，液體試劑為體積百分 比。
[0034] 實(shí)施例1AK404R-MICA質(zhì)粒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染
[0035] 抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2的單鏈抗體基因用pHEN2-AKA404R(實(shí)驗(yàn)室保存） 擴(kuò)增獲得，據(jù)此設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，上游引物P1:5'-GGAATTCGAGGTGCAGCTGGTG-3'和下游引 物P2:5'-GGITCTGAACCACCACCACCACCTAGGACGGTCAG-3'，MICA基因用pET2