一種誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為脂肪樣細(xì)胞的培養(yǎng)基及其誘導(dǎo)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于干細(xì)胞領(lǐng)域，具體涉及一種誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為脂肪樣細(xì)胞的培養(yǎng)基及其誘導(dǎo)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著生活方式的改變，肥胖在世界范圍內(nèi)已經(jīng)成為影響人類健康的一個重要問題。而肥胖易導(dǎo)致心血管疾病、糖尿病及腫瘤等一系列代謝疾病的并發(fā)。已有許多研宄證實脂肪細(xì)胞分化和調(diào)控的失常與糖和脂肪的代謝、糖尿病、結(jié)腸癌、乳腺癌和心血管疾病等的生理及病理過程有密切關(guān)聯(lián)。目前，這種由肥胖而導(dǎo)致的多種代謝疾病在世界范圍內(nèi)的廣泛流行使得人們越來越關(guān)注脂肪代謝和分化調(diào)控的機制研宄。因而，闡明脂肪細(xì)胞的發(fā)生過程，揭示脂肪細(xì)胞分化及調(diào)控中的細(xì)胞分子水平的機理，可以為肥胖相關(guān)疾病的預(yù)防和治療提供堅實的理論基礎(chǔ)，特別是針對上述疾病進行細(xì)胞分子水平的藥物篩選，具有重要的現(xiàn)實意義。
[0003]另一方面，作為再生醫(yī)學(xué)和組織工程領(lǐng)域的研宄熱點之一，脂肪組織再生技術(shù)是重建和修復(fù)由老化和病理因素等導(dǎo)致的脂肪組織丟失和損傷的重要技術(shù)手段。而脂肪細(xì)胞作為脂肪再生工程的種子細(xì)胞來源，可大大地驅(qū)動新生組織的重建。
[0004]基于以上兩個方面的應(yīng)用，我們需要一個高效、快捷和穩(wěn)定的脂肪分化平臺作為以上研宄和應(yīng)用的載體。當(dāng)前以間充質(zhì)干細(xì)胞為來源誘導(dǎo)脂肪分化采用策略主要是各種生長因子來聯(lián)合誘導(dǎo)，但是效率低下，同時還需要幾周的時間來獲得成熟的定向分化細(xì)胞，不僅僅是誘導(dǎo)周期長，還在一定程度上增加了成本花費。因此，傳統(tǒng)的技術(shù)手段一定程度上削弱了其在臨床治療和組織工程中的應(yīng)用價值。
[0005]研宄表明，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞易于獲取，體外增殖分化能力強，是非常有前途的細(xì)胞治療用細(xì)胞來源。然而怎樣才能將其高效誘導(dǎo)分化成脂肪樣細(xì)胞，用于細(xì)胞生物治療其中仍存在許多問題亟需解決:1)干細(xì)胞分化為脂肪樣細(xì)胞，受干擾因素非常多，首先是分化周期長；2)采用的誘導(dǎo)因子復(fù)雜，不能保證干細(xì)沿預(yù)期方向分化、增殖，獲得分化后的細(xì)胞不純；3)多采用巰基乙醇，其毒性令人望而卻步，影響后續(xù)臨床應(yīng)用；4)誘導(dǎo)分化后的脂肪樣細(xì)胞胰島素分泌效率低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決上述存在的問題，本發(fā)明建立了一種簡便的、新穎的誘導(dǎo)方法，可高效、快速地將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)為類脂肪細(xì)胞。
[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為脂肪樣細(xì)胞的培養(yǎng)基本發(fā)明的另一目的在于提供一種誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為脂肪樣細(xì)胞的方法。
[0008]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是: 一種誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為脂肪樣細(xì)胞的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有以下組分: 葡萄糖1mM?20mM ；
四氧化三鐵納米顆粒50Pg/ml?400Pg/ml ；
胰島素1nM?30nM ；
青霉素80?120 U /L ；
鏈霉素80?120 U /L ；
L-DMEM培養(yǎng)基余量。
[0009]進一步的，上述培養(yǎng)基含有以下組分:
葡萄糖17.5mM ；
四氧化三鐵納米顆粒300Pg/ml ；
胰島素20nM ；
青霉素100 U /L ；
鏈霉素100 U /L ；
L-DMEM培養(yǎng)基余量。
[0010]一種誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為脂肪樣細(xì)胞的方法，包括以下步驟:將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞用上述所述的培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)至少9天即可獲得脂肪樣細(xì)胞。
[0011]進一步的，上述在誘導(dǎo)培養(yǎng)前先將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進行融合培養(yǎng)，當(dāng)60?70%的干細(xì)胞進行融合時，去除融合培養(yǎng)的培養(yǎng)基，并將細(xì)胞洗滌干凈后，加入上述所述的培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0012]進一步的，上述誘導(dǎo)培養(yǎng)至少9天后即可獲得成熟的脂肪樣細(xì)胞。
[0013]本發(fā)明的有益效果是:
O誘導(dǎo)培養(yǎng)基含有簡單的兩種誘導(dǎo)因子，四氧化三鐵納米顆粒與胰島素因子相互作用，誘導(dǎo)效果更好；不含有毒有害物質(zhì)，更安全。
[0014]2)本發(fā)明誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為脂肪樣細(xì)胞的方法，3天即可獲得脂肪樣細(xì)胞，9天可獲得成熟的脂肪樣細(xì)胞，與現(xiàn)有技術(shù)7?20天的誘導(dǎo)時間相比，大大縮短了誘導(dǎo)分化時間；
3)人臍帶組織易于獲得；分化后脂肪樣細(xì)胞的特異性基因表達更高，可為脂肪缺失相關(guān)疾病細(xì)胞治療提供理想的種子細(xì)，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0015]圖1 UC-MSCs經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)9天后的油紅O染色圖；A為未分化的陰性對照組(Control)細(xì)胞染色情況，B為經(jīng)傳統(tǒng)誘導(dǎo)方法(tradit1nal diff)培養(yǎng)后的細(xì)胞染色，C為經(jīng)本發(fā)明方法(our method)誘導(dǎo)培養(yǎng)后細(xì)胞的染色情況；
圖2為對各組細(xì)胞被紅O染色成紅色的區(qū)域的統(tǒng)計；Un-diff表示陰性對照組中未分化的UC-MSCs ；tradit1nal diff表示傳統(tǒng)分化誘導(dǎo)培養(yǎng)方法；our method表示本發(fā)明分化誘導(dǎo)培養(yǎng)方法；
圖3為UC-MSCs經(jīng)不同方法誘導(dǎo)培養(yǎng)后轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ 2的表達水平；Undiff_MSCs表示陰性對照組中未分化的UC-MSCs ；tradit1nal diff表示傳統(tǒng)分化誘導(dǎo)培養(yǎng)方法；ourmethod表示本發(fā)明分化誘導(dǎo)培養(yǎng)方法；
圖4為實施例4中誘導(dǎo)UC-MSCs分化而成的脂肪樣細(xì)胞，A為誘導(dǎo)前UC-MSCs細(xì)胞，B為本發(fā)明方法誘導(dǎo)UC-MSCs分化9天后而成的脂肪樣細(xì)胞，圖標(biāo)代表50 Mm。
【具體實施方式】
[0016]一種誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為脂肪樣細(xì)胞的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有以下組分:
葡萄糖1mM?20mM ；
四氧化三鐵納米顆粒50Pg/ml?400Pg/ml ；
胰島素1nM?30nM ；
青霉素80?120 U /L ；
鏈霉素80?120 U /L ；
L-DMEM培養(yǎng)基余量。
[0017]優(yōu)選的，上述培養(yǎng)基含有以下組分:
葡萄糖17.5mM ；
四氧化三鐵納米顆粒300Pg/ml ；
胰島素20nM ；
青霉素100 U /L ；
鏈霉素100 U /L ；
L-DMEM培養(yǎng)基余量。
[0018]一種誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為脂肪樣細(xì)胞的方法，包括以下步驟:將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞用上述所述的培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)至少9天即可獲得脂肪樣細(xì)胞。
[0019]優(yōu)選的，上述在誘導(dǎo)培養(yǎng)前先將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進行融合培養(yǎng)，當(dāng)60?70%的干細(xì)胞進行融合時，去除融合培養(yǎng)的培養(yǎng)基，并將細(xì)胞洗滌干凈后，加入上述所述的培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0020]優(yōu)選的，上述誘導(dǎo)培養(yǎng)至少9天后即可獲得成熟的脂肪樣細(xì)胞。
[0021]優(yōu)選的，上述誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中每三天換一次液。
[0022]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0023]實施例1:一種誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為脂肪樣細(xì)胞的培養(yǎng)基一種誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為脂肪樣細(xì)胞的培養(yǎng)基含有以下組成:
葡萄糖17.5mM ；
四氧化三鐵納米顆粒300Pg/ml ；
胰島素20nM ；
青霉素100 U /L ；
鏈霉素100 U /L ；
L-DMEM培養(yǎng)基余量。
[0024]上述培養(yǎng)基的制備:先將Fe3O4納米顆粒加入到L-DMEM培養(yǎng)基(為市售的L-DMEM培養(yǎng)基)中，使終濃度為300 μ g/mL，將胰島素、青霉素和鏈霉素加入到上述溶液中，置于37°C孵育半個小時即可。
[0025]實施例2:—種誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為脂肪樣細(xì)胞的培養(yǎng)基一種誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為脂肪樣細(xì)胞的培養(yǎng)基含有以下組成:
葡萄糖20mM ；
四氧化三鐵納米顆粒400Pg/ml ；
胰島素1nM ；
青霉素100 U /L ；
鏈霉素100 U /L ；
L-DMEM培養(yǎng)基余量。
[0026]上述培養(yǎng)基的制備:先將Fe3O4納米顆粒加入到L-DMEM培養(yǎng)基(為市售的L-DMEM培養(yǎng)基)中，使終濃度為400 μ g/mL，再將胰島素、青霉素和鏈霉素加入到上述溶液中，置于37°C孵育半個小時即可。
[0027]實