一種鯽魚皰疹病毒病jdorf25疫苗及制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種鯽魚皰疹病毒病疫苗（JD0RF25)及制備方法 和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 鯉皰疫病毒II型（Cyprinid herpesvirus II，CyHV-2)感染異育銀鯽是近年新出 現(xiàn)的一種嚴(yán)重病毒性疾病，已經(jīng)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。鯉皰疹病毒II型最早在觀賞金魚中發(fā) 現(xiàn)，稱為"金魚皰疹病毒性造血器官壞死癥"。該病毒因其是第二個分離自鯉科魚的皰疹病 毒，國際病毒系統(tǒng)分類與命名委員會將其命名為鯉皰疹病毒II型（CyHV-2)。CyHV-2與鯉 痘瘡病毒（Car p pox herpesvirus, Cyprinid herpesvirus I，CyHV-1)及錦鯉皰疫病毒 (Koi herpesvirus, Cyp rinid herpesvirus3，CyHV_3)的關(guān)系接近，屬于鯉皰疫病毒科成 員，目前CyHV-2的全基因組測序與注釋研究已經(jīng)完成，對CyHV-2重要功能基因的研究正陸 續(xù)展開，但對病毒疫苗制備方面研究相對較少。CyHV-2 0RF25是一個重要的免疫相關(guān)基因， 存在一個跨膜結(jié)構(gòu)域，是制備預(yù)防鯽魚皰疹病毒病疫苗的重要靶基因。本發(fā)明通過對鯉皰 疹病毒II型0RF25基因編碼蛋白進(jìn)行分析，選擇親水性和抗原性強的區(qū)域表達(dá)制備疫苗。
[0003] 巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris)是一種新型真核表達(dá)系統(tǒng)，能穩(wěn)定高效表達(dá) 外源蛋白，并能對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行翻譯后加工和修飾，同時，其成熟的高密度發(fā)酵技術(shù)為目的 蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)提供了保障。自1984年應(yīng)用畢赤酵母表達(dá)外源蛋白以來，已有400多種 蛋白在該系統(tǒng)中成功表達(dá)，部分成果已進(jìn)入商品化生產(chǎn)。
[0004] 由于遺傳密碼具有簡并性，一種氨基酸可以有1-6個使用頻率不同的同義密碼 子。對于特定的物種，高表達(dá)的基因往往使用部分特定的同義密碼子，這些密碼子被認(rèn)為是 該物種高表達(dá)基因的優(yōu)越密碼子，這種現(xiàn)象稱為密碼子偏愛性。密碼子的偏愛性使得克隆 的外源基因往往難以在異種生物細(xì)胞高效表達(dá)。在酵母中獲得高效表達(dá)的外源基因往往 都是酵母偏愛密碼子所編碼的基因，通過對酵母基因使用密碼子的統(tǒng)計分析證實所有的61 個密碼子中有25個是酵母所偏愛的，因此對密碼子進(jìn)行偏愛性改造能大量提高重組蛋白 在該系統(tǒng)中的表達(dá)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供了一種鯽魚皰疹病毒病疫苗，該疫苗為將鯉皰疹病毒II型 免疫相關(guān)0RF25基因截短優(yōu)化后翻譯的重組蛋白JD0RF25,其序列為SEQ ID N0. 2所示，對 應(yīng)的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示。
[0006] 本發(fā)明的另一個目的在于提供了一種鯽魚皰疹病毒病疫苗的制備方法，申請人提 供了一株巴斯德畢赤酵母 Km71/CyHV-2_25 Pichia pastoris Km71/CyHV-2_25 菌株，該菌 株包含有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，將該菌株發(fā)酵可制備鯽魚皰疹病毒病疫苗。該菌 株已于2014年11月18日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號：CCTCC NO :M2014570， 分類命名：巴斯德畢赤酵母 Km71/CyHV-2-25 Pichia pastoris Km71/CyHV-2-25,地址：中 國武漢武漢大學(xué)。
[0007] 本發(fā)明的最后一個目的在于提供了一種鯽魚皰疹病毒病疫苗在制備鯉皰疹病毒 II型疫苗中的應(yīng)用。
[0008] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：
[0009] -種鯽魚皰疹病毒病疫苗的獲得：
[0010] 分析Genbank公布的鯉皰疹病毒II型免疫相關(guān)0RF25基因（JQ815364. 1)，找到親 水性和抗原性強的區(qū)域，按酵母密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化，合成該基因片段，其序列為SEQ ID NO. 1所示，根據(jù)優(yōu)化片段的基因序列設(shè)計引物（JD0RF25 IF和JD0RF25 1R)進(jìn)行PC R反 應(yīng)，克隆獲得截短優(yōu)化的0RF25基因，轉(zhuǎn)入酵母表達(dá)載體，獲得重組表達(dá)載體，然后再將其 導(dǎo)入酵母表達(dá)菌種，篩選高拷貝克隆，獲得重組畢赤酵母表達(dá)菌，該菌株已于2014年11月 18日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號：CCTCC N0:M2014570,分類命名：巴斯德畢 赤酵母 Km71/CyHV-2-25 Pichia pastoris Km71/CyHV-2-25,地址：中國武漢武漢大學(xué)。
[0011]上述巴斯德畢赤酵母 Km71/CyHV-2-25 Pichia pastoris Km71/CyHV-2-25 CCTCC N 0 :M2014570的菌學(xué)特征為：該酵母菌是單細(xì)胞真核生物，橢圓形，不運動，營養(yǎng)細(xì)胞為單 體，可在含有2mg/mL Zeocin抗生素的YPDS平板上培養(yǎng)，液體培養(yǎng)條件下以單細(xì)胞形式存 在，固體培養(yǎng)時。呈菌落存在，菌落表面濕潤、光滑、為乳白色。依次通過BMGY和BMMY培養(yǎng) 基培養(yǎng)后，上清液中含有鯉皰疹病毒II型JD0RF25蛋白。
[0012] 上述巴斯德畢赤酵母Km71/CyHV-2-25 Pichia pastoris Km71/CyHV-2-25 的構(gòu)建 方法具體為：
[0013] 1)合成SEQ ID NO. 1所示為JD0RF25基因的核苷酸序列。
[0014] 2)引物設(shè)計
[0015] JD0RF25 1F :5' -CGGAATTCCGACTCAAAACACTACTACTAC-3' (含 EcoR I 酶切位點）
[0016] JD0RF25 1R :5' -TCCCCGCGGCGTTAGCACCGTATGGAGTAG-3' (含 Sac II 酶切位點）。
[0017] 3) PCR 獲取 JD0RF25 基因
[0018] 以JD0RF25 1F/JD0RF25 1R為引物，優(yōu)化合成的JD0RF25基因為模板進(jìn)行PCR，回 收PCR產(chǎn)物。
[0019] 4)將獲取的目的基因克隆入pPICZa B表達(dá)載體并進(jìn)行序列測定
[0020] PCR產(chǎn)物和pPICZa B均用EcoR I、Sac II雙酶切，T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn) 物轉(zhuǎn)化E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，從含25iig/mL Zeocin的LB平板上挑取單克隆，小量 提取質(zhì)粒，用酵母特異引物 5' -A0X (5' -GACTGGITCCAAITGACAAGC-3'）和 3' -A0X (5' -GCA AATGGCAITCTGACATCC-3'）進(jìn)行 PCR 鑒定，同時進(jìn)行 Sac II 單酶切，EcoR I、Sac II 雙酶切 鑒定。陽性連接產(chǎn)物命名為：pPICZaB-CyHV-2-25。
[0021] 5)電轉(zhuǎn)酵母菌及轉(zhuǎn)化子的篩選
[0022] 重組質(zhì)粒pPICZ a B-CyHV-2-25經(jīng)Sac I酶切線性化后，異丙醇沉淀回收，同時酶 切空載體設(shè)為對照。酵母KM71感受態(tài)細(xì)胞的制備參考EasySelect Pichia expression kit user m anual, Invitrogen。將10 u L線性化的重組質(zhì)粒（約6 u g)與80 u L酵母感 受態(tài)細(xì)胞混合，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的〇. 2cm電轉(zhuǎn)杯中，置冰上5min，1. 5kV電擊6. 8毫秒后，立即加 入lmL預(yù)冷的lmol/L山梨醇，30°C復(fù)蘇2h，取菌液200 y L涂布在含100 y g/mL Zeocin的 YPDS平板上，30°C培養(yǎng)2?4天，直單克隆出現(xiàn)。
[0023] 從含有100 ii g/mL Zeocin的YPDS抗性平板上隨機(jī)挑取單克隆，按酵母基因組DNA 提取試劑盒（OMEGA)操作說明提取重組酵母DNA進(jìn)行PCR鑒定，所用引物為酵母通用引物 A0X I。對鑒定后的重組酵母-80°C保存，對鑒定后的重組酵母_80°C保存。
[0024] 轉(zhuǎn)化子高拷貝篩選：取出凍存的陽性轉(zhuǎn)化子，在無抗性的YH)液體培養(yǎng)中活化。將 200 y L菌液涂布于Zeocin抗生素濃度逐漸升高（0? 5mg/mL，lmg/mL和2mg/mL)的YPDS平 板上，30°C培養(yǎng)2?5d，每天觀察菌落生長情況。挑取在高濃度平板上生長較快且顆粒飽 滿的單克隆在YH)平板上劃線純化，即得重組畢赤酵母表達(dá)菌，該菌株已于2014年11月 18日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號：CCTCC N0:M2014570,分類命名：巴斯德畢 赤酵母 Km71/CyHV-2-25 Pichia pastoris Km71/CyHV-2-25,地址：中國武漢武漢大學(xué)。6) 重組酵母菌的誘導(dǎo)表達(dá)及產(chǎn)物鑒定
[0025]將畢赤酵母 Km71/CyHV-2-25 接種到 100mL BMGY 培養(yǎng)基中，30°C、250r/min 振蕩 培養(yǎng)至0D_值達(dá)6左右，室溫1500g離心5min，20mL BMMY培養(yǎng)基重懸菌體，所得菌液轉(zhuǎn)入 100mL的搖瓶，封瓶膜封口，加入100%甲醇至終濃度0. 5%，于30°C、250r/min的條件下誘 導(dǎo)培養(yǎng)，每24h補加甲醇，使甲醇濃度維持0. 5%。連續(xù)誘導(dǎo)3天后，通過離心去除誘導(dǎo)液中 的酵母菌（去除沉淀，留上清），上清經(jīng)過低溫冷凍干燥和his純化的方式進(jìn)行濃縮純化，即 得鯽魚皰疹病毒病疫苗重組蛋白JD0RF25,蛋白序列為SEQ ID N0. 2所示。
[0026] -種鯽魚皰疹病毒病疫苗在制備鯉皰疹病毒II型疫苗中的應(yīng)用，將該疫苗直接注 射于鯽魚體內(nèi)，或與其他疫苗佐劑混合，可起到抗鯉皰疹病毒II型的效果。
[0027] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
[0028] 1.畢赤酵母曾作為單細(xì)胞蛋白廣泛應(yīng)用，本身就具有很好的安全性，并且酵母培 養(yǎng)基中不含有毒物質(zhì)和致熱源；
[0029] 2.本發(fā)明生產(chǎn)的疫苗抗原是中和性抗原蛋白，而不是滅活或者減毒的鯉皰疹病毒 II型，因此該疫苗安全可靠；
[0030] 3.本發(fā)明涉及的疫苗用抗原是蛋白質(zhì)，與其他新型疫苗（如活載體疫苗、核酸疫 苗、基因缺失疫苗）相比不會發(fā)生可能出現(xiàn)的基因重組問題，因此本發(fā)明不存在生物安全 性問題。
[0031] 4.本發(fā)明以酵母作為目的蛋白的表達(dá)載體，培養(yǎng)簡單，可以用發(fā)酵罐規(guī)?；a(chǎn)， 可以實現(xiàn)質(zhì)量控制，保證所生產(chǎn)的疫苗安全有效；
[0032] 5.本發(fā)明以酵母作為目的蛋白的表達(dá)載體，與大腸桿菌原核表達(dá)相比，表達(dá)量要 高，其活性要遠(yuǎn)高于包涵體蛋白。酵母表達(dá)系統(tǒng)是一種簡單的真核表達(dá)系統(tǒng)，能穩(wěn)定高效表 達(dá)外源蛋白，并能對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行翻譯后加工和修飾，同時，其成熟的高密度發(fā)酵技術(shù)為目 的蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)提供了保障，因此采用鯉皰疹病毒II型免疫相關(guān)0RF25基因截短優(yōu)化 后翻譯的重組蛋白（JD0RF25)為亞單位疫苗可以完全