>[0152] PCR反應(yīng)循環(huán)反應(yīng)為：
[0153] 94°C預(yù)變性 2min ;98°C變性 10s ;60°C退火 30s ;68°C延伸 30s ;循環(huán)數(shù) 20。
[0154] B-3以含有待用抗體輕鏈可變區(qū)的質(zhì)粒為模板，用引物對(duì)3進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得片 段3(324bp如圖4)。反應(yīng)體系為50 y 1體系，做兩管。
[0155] PCR反應(yīng)體系為：
[0156] dNTPs 5 y1 ;K0D-PLUS-NE0 10*buffer 5 y1 ;MgS043 y1 ;K0D-PLUS-NE01y1 ;輕 鏈可變區(qū)質(zhì)粒lul ;引物對(duì)3正向引物1.5yl ;引物對(duì)3反向引物1.5yl ;雙蒸水32yl ; 總共50y 1。
[0157] PCR反應(yīng)循環(huán)反應(yīng)為：
[0158] 94°C預(yù)變性 2min ;98°C變性 10s ;61°C退火 30s ;68°C延伸 15s ;
[0159] 循環(huán)數(shù)20。
[0160] B-4以待用抗體重鏈鏈可變區(qū)質(zhì)粒為模板，用引物對(duì)4進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得片段 4(366bp如圖4)。反應(yīng)體系為50yl體系，做兩管。
[0161] PCR反應(yīng)體系為：
[0162] dNTPs 5 y1 ;K0D-PLUS-NE0 10*buffer 5 y1 ;MgS043 y1 ;K0D-PLUS-NE01y1 ;重 鏈可變區(qū)質(zhì)粒lul ;引物對(duì)4正向引物1.5yl ;引物對(duì)4反向引物1.5yl ;雙蒸水32yl ; 總共50y 1。
[0163] PCR反應(yīng)循環(huán)反應(yīng)為：
[0164] 94°C預(yù)變性 2min ;98°C變性 10s ;65°C退火 30s ;68°C延伸 15s ;
[0165] 循環(huán)數(shù)20。
[0166] B-5
[0167] PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳分離后，可分別見7107bp、1035bp、324bp和366bp的擴(kuò) 增條帶（圖4)，將目的條帶分別切下，用公司瓊脂糖凝膠純化試劑盒進(jìn)行純化，方法是：
[0168] 1、從瓊脂糖凝膠中將PCR產(chǎn)物DNA條帶切下，轉(zhuǎn)入離心管中，加入2倍體積的結(jié)合 緩沖液，55°C下溫浴7分鐘使得凝膠溶解；
[0169] 2、將離心管中溶解的凝膠溶液轉(zhuǎn)移到試劑盒自帶的DNA吸附柱中，13000轉(zhuǎn)/分鐘 離心2分鐘；
[0170]3、向DNA吸附柱中加入700 y 1漂洗液，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘；棄去漂洗液， 再加入500 y 1漂洗液，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘；棄去漂洗液后，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心2 分鐘，室溫放置5分鐘；
[0171] 4、將DNA吸附柱加入一個(gè)新的離心管中，加入65°C預(yù)熱的洗脫緩沖液70 y 1， 13000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，離心管底的溶液即為回收的PCR產(chǎn)物DNA片段。
[0172] C、進(jìn)行第一次重疊PCR(獲得片段5,長度為1665bp，如圖片5):將各反應(yīng)片段（小 片段2、片段3、片段4)按1:1?1:5的比例[(片段大小*片段濃度）之比；大片段：小片 段]加入到25ul PCR反應(yīng)體系中，確保個(gè)片段的加入量在100ng?300ng之間。經(jīng)計(jì)算， 在試驗(yàn)中各片段的加入量分別為：小片段2 :5. 3 y 1，片段3 :1. 1 y 1，片段4 :1. 1 y 1。
[0173] PCR反應(yīng)體系為：
[0174] dNTPs 2.5 y1 ；K0D-PLUS-NE0 10*buffer 2.5 y1 ；MgS041. 5 y1 ；K0D-PLUS-NE0 0? 5 y 1 ;小片段 25. 3 y 1 ;片段 31. 1 y 1 ;片段 41. 1 y 1 ;雙蒸水 10. 5 y 1 ;總共 25 y l〇
[0175] PCR反應(yīng)循環(huán)反應(yīng)為：
[0176] 94°C預(yù)變性 2min ;98°C變性 10s ;60°C退火 30s 68°C延伸 60s ;循環(huán)數(shù) 6。
[0177] 取1 y 1上述重疊PCR反應(yīng)液作為模板，進(jìn)行片段5的進(jìn)一步擴(kuò)增。
[0178] PCR反應(yīng)體系為：
[0179] dNTPs 5 y 1 ；K0D-PLUS-NE0 10*buffer 5 y 1 ；MgS043 y1 ；K0D-PLUS-NE01y1 ； 重疊PCR反應(yīng)液lyl ;末端正向引物1.5yl ;末端反向引物1.5yl ;雙蒸水32yl ;總共 50 y l〇
[0180] PCR反應(yīng)循環(huán)反應(yīng)為：
[0181] 94°C預(yù)變性 2min ;98°C變性 10s ;63°C退火 30s ;68°C延伸 60s ;循環(huán)數(shù) 16。
[0182] PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳分離后，可見1665bp的擴(kuò)增條帶，將目的條帶切下，用 公司瓊脂糖凝膠純化試劑盒進(jìn)行純化，方法是：
[0183] 1、從瓊脂糖凝膠中將PCR產(chǎn)物DNA條帶切下，轉(zhuǎn)入離心管中，加入2倍體積的結(jié)合 緩沖液，55°C下溫浴7分鐘使得凝膠溶解；
[0184] 2、將離心管中溶解的凝膠溶液轉(zhuǎn)移到試劑盒自帶的DNA吸附柱中，13000轉(zhuǎn)/分鐘 離心2分鐘；
[0185]3、向DNA吸附柱中加入700 y 1漂洗液，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘；棄去漂洗液， 再加入500 y 1漂洗液，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘；棄去漂洗液后，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心2 分鐘，室溫放置5分鐘；
[0186] 4、將DNA吸附柱加入一個(gè)新的離心管中，加入65°C預(yù)熱的洗脫緩沖液70 y 1， 13000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，離心管底的溶液即為回收的PCR產(chǎn)物DNA片段。
[0187] D、進(jìn)行第二次重疊PCR(獲得完整的人源抗體表達(dá)質(zhì)粒大小為8772bp，如圖片5): 將各反應(yīng)片段（大片段1和片段5)按1:1?1:5的比例[(片段大小*片段濃度）之比， 大片段：小片段]加入25ul PCR反應(yīng)體系中，確保各片段的加入量在100ng?300ng之間。 經(jīng)計(jì)算，大片段1的加入量選擇3. 8 y 1，片段五的加入量選擇4. 2 y 1。
[0188] PCR反應(yīng)體系為：
[0189] dNTPs 2.5 y1；KOD-PLUS-NEO 10*buffer 2.5 y1；MgS041. 5 y1；KOD-PLUS-NEO 〇? 5 y 1 ;大片段13. 8 y 1 ;片段54. 2 y 1 ;雙蒸水10 y 1 ;總共25 y 1。
[0190] PCR反應(yīng)循環(huán)反應(yīng)為：
[0191] 94°C預(yù)變性 2min ;98°C變性 10s ;63°C退火 30s ;68°C延伸 5min ;循環(huán)數(shù) 16。
[0192] E-l、轉(zhuǎn)化大腸桿菌：將步驟D獲得的重疊PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中， 在含有氨芐青霉素1〇〇 u 1/ml的LB培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)12-16小時(shí)，方法是：
[0193] a、取步驟D獲得的重疊PCR產(chǎn)物5ul加到50ul的感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕搖勻，冰浴 30min.
[0194] b、42°C熱激90s，快速轉(zhuǎn)到冰浴2-3min，注意不要搖動(dòng)管。
[0195] c、向管中加入 500ul 的 LB 培養(yǎng)基，150rmp, 37°C，45min。
[0196] d、將菌液全部涂到LB平板上，含100ug/ml Amp。
[0197] e、將平板正置直至液體全部吸收。
[0198] f、倒置平板，于37°C培養(yǎng)12 - 16h。
[0199] E-2、篩選重組真核表達(dá)載體的陽性克?。簩⒕浞糯笈囵B(yǎng)，純化提取質(zhì)粒，方法 是：
[0200] a.挑取轉(zhuǎn)化后的單菌落，接種到2ml含有氨芐青霉素（100 y g/ml)的LB培養(yǎng)基 中，37°C，150rpm，搖床培養(yǎng) 12 ?16hr。
[0201] b?取1-1. 5ml培養(yǎng)物倒入1. 5ml離心管中，4°C，13000rpm離心30s，棄上清，然后 再短暫離心，用槍頭將離心管底部少量殘液吸出棄掉。剩余菌液4°C保存。
[0202] c.將細(xì)胞沉淀漩渦震蕩打散后，重懸于100 yl冰預(yù)冷的堿裂解液I中，漩渦震 蕩，使細(xì)菌懸浮均勻。
[0203] d.細(xì)菌重懸液中加入200 y 1堿裂解液II，上下翻轉(zhuǎn)離心管5次，使菌體充分裂解， 直至形成透亮的溶液，置于冰上（<5min)。
[0204] e.加入150 y 1冰預(yù)冷的堿裂解液III，上下翻轉(zhuǎn)離心管8次，使溶液III在粘稠 的細(xì)菌裂解物中分散均勻，并將離心管置于冰上1?31^11，41：，13000印111離心5111111，將? 400 y 1的上清轉(zhuǎn)移至另一個(gè)離心管中。
[0205]f?加400 y 1酚：氯仿（V: V = 1:1)，震蕩充分混合有機(jī)相和水相，13000rpm離心 2min，取上清于新離心管中。
[0206] g.用2?2. 5體積的乙醇（850 y 1)室溫沉淀核酸，混合均勻，室溫靜置2min。 13000rpm離心5min。小心的把上清倒掉；然后再短暫離心，用槍頭把離心管底部少量殘液 小心的吸出棄掉。
[0207] h.加1ml左右70%乙醇于沉淀中，顛倒離心管數(shù)次，洗滌管壁與沉淀，如沉淀偏離 管底需13000rpm離心lmin。小心的把上清倒掉，然后再短暫離心，用槍頭把離心管底部少 量殘液小心的吸出（若沉淀漂浮，用槍頭將其置于離心管底部）。
[0208] i.打開離心管，室溫靜置3?5min，使乙醇充分揮發(fā)，直至離心管內(nèi)沒有可見的液 體存在。
[0209] j?加50 y 1 TE緩沖液（含20 y g/ml RNase A)于離心管中，靜置5min，溫和震蕩 混勻。貯存于-20 °C。
[0210] F、用Xbal酶和BamHI酶進(jìn)行酶切鑒定，初步證實(shí)得到的序列是真核表達(dá)質(zhì)粒。
[0211] 酶切體系是：
[0212] 10*Green buffer 2