一種基于細胞生物物理特性的抗肺纖維化藥物活性評價體系的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于細胞生物物理特性的抗肺纖維化藥 物活性評價體系。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，隨著我國空氣污染形勢的日益嚴峻，以空氣污染為潛在誘發(fā)因素的諸多 疾病備受關(guān)注，其主要集中在呼吸系統(tǒng)疾病方面，而間質(zhì)性肺病作為呼吸系統(tǒng)疾病重要的 組成部分成為主要研宄對象之一。其中，以特發(fā)性肺纖維化（IPF)最具代表性，它是一種以 肺實質(zhì)纖維化為主要特征的間質(zhì)性肺病。IPF作為多種間質(zhì)性肺病共同的惡化發(fā)展最終形 式而普遍存在，初次確診后的中位存活年限為2-3年，是大多數(shù)間質(zhì)性肺病的直接致死因 素。
[0003]目前臨床對IPF的治療方案主要基于免疫反應(yīng)，炎癥反應(yīng)在肺纖維化過程中的協(xié) 同作用，聯(lián)合使用抗炎，免疫抑制藥物以延緩纖維化進程，該方案因其療效的不確定性以及 不良反應(yīng)復(fù)雜性而未能廣泛應(yīng)用。而肺移植雖然是纖維化末期唯一有效的治療手段，但它 同樣面臨器官供體缺乏，手術(shù)成活率低，術(shù)后難恢復(fù)等問題。由此可見，特異性強、療效確切 的抗肺纖維化藥物極其缺乏。
[0004] 成熟穩(wěn)定的肺纖維化病理模型是活性化合物篩選的基礎(chǔ)，當前普遍應(yīng)用的肺纖維 化模型主要為在體動物模型，選用抗腫瘤藥物博萊霉素，利用其誘發(fā)肺間質(zhì)纖維化的副作 用，通過氣管注射給藥形成肺纖維化動物模型。該模型主要以肺組織切片的組織形態(tài)學(xué)特 征作為考察指標，該模型從整體水平直觀反映纖維化程度，具有較高的臨床參考價值。然而 該模型同樣存在模型動物個體差異大，纖維化程度定量難，觀測周期長，造模成本高，給藥 量大等不足。單獨應(yīng)用該模型無法充分滿足活性化合物高效篩選的需要。現(xiàn)有的體外模型 中，肺上皮細胞A549經(jīng)轉(zhuǎn)化生長因子e(TGF-e)誘導(dǎo)造模成纖維化狀態(tài)為公認的抗纖維 化體外模型，目前的技術(shù)對此模型的評價多采用免疫學(xué)的檢測方法，如E-cadherin、a-SMA 和vimentin等蛋白的表達，由于以上技術(shù)操作復(fù)雜、費時費力、缺乏系統(tǒng)性因而不能快速 提供準確的定量信息，且以上蛋白表達的改變并不能準確反應(yīng)纖維化的進程，同時評價結(jié) 果不能可視化，因此，急需一種操作簡單、結(jié)果可靠的抗纖維化藥物篩選技術(shù)體系，以便快 速的、準確的、高通量的對候選化合物進行抗纖維化活性的篩選。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對現(xiàn)有的抗肺纖維化藥物活性評價體系存在的不足，發(fā)明人經(jīng)過大量的實驗研 宄，基于經(jīng)典的體外肺纖維化模型，發(fā)現(xiàn)了肺上皮細胞A549造模前后及藥物處治前后的生 物物理特性，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析比較存在顯著差異，從而通過細胞生物物理特性的變化來評價 抗肺纖維化藥物的活性。通過主成分分析法統(tǒng)計比較，將細胞硬度作為主要評價指標建立 一種定量的、快速的、可視化的抗肺纖維化藥物活性評價體系。
[0006] 本發(fā)明提供種一種基于細胞生物物理特性的抗肺纖維化藥物活性評價體系，該評 價方法的步驟為：
[0007]a.細胞經(jīng)培養(yǎng)，前期處理得到待測樣品；
[0008] b.對步驟a所得對照組、模型組及給藥組細胞的硬度、長度及表面粗糙度進行檢 測，得到評價指標值；
[0009] C.將對照組與模型組，模型組及給藥組的細胞硬度評價指標分別進行統(tǒng)計學(xué)分 析，得出模型成功與否及有無抗纖維化活性的評價結(jié)果。
[0010] 上述步驟a模型組選取肺上皮細胞A549經(jīng)轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-e)誘導(dǎo)，形成 肺纖維化體外模型；給藥組選取的陽性藥為N-乙酰-L-半胱氨酸。
[0011] 發(fā)明人實驗過程中發(fā)現(xiàn)，A549細胞經(jīng)TGF-0誘導(dǎo)刺激前后其微觀形態(tài)、結(jié)構(gòu)及機 械特性等物理特征存在明顯差異。如細胞的形狀及其表面粗糙度，經(jīng)TGF-0誘導(dǎo)刺激后， 細胞會從原來的卵圓形變?yōu)樗笮?、而其表面粗糙度較刺激前顯著增加；再如，細胞的機械強 度，即，細胞的硬度值，造模后顯著增高。反之，陽性藥預(yù)先處治后，以上由TGF-0誘導(dǎo)的細 胞生物物理特征的轉(zhuǎn)變將會被抑制；根據(jù)上述細胞生物物理特性指標在肺纖維化體外模型 藥物處治前后的對應(yīng)關(guān)系，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，發(fā)明人建立了本發(fā)明所述的抗肺纖維化藥物活 性評價體系。本發(fā)明僅需在體外的細胞水平，便可進行可視化的、準確的定量分析，從而對 藥物的抗纖維化活性進行評價，該評價方法檢測成本低，耗時短，可滿足快速大量篩選的要 求。
[0012] 所述步驟a的細胞為肺上皮細胞，前期處理包括轉(zhuǎn)化生長因子0 (TGF-0)及其他 可誘導(dǎo)細胞形成纖維化的刺激因子。
[0013] 所述步驟b的檢測，可選用能對細胞的超微結(jié)構(gòu)和機械特性進行精確成像的分析 儀器，優(yōu)選采用原子力顯微鏡（AFM)。
[0014] 所述步驟c的評價結(jié)果通過以下標準判斷得出：
[0015] 模型成功：模型組細胞硬度較對照組增加，且模型組與對照組細胞硬度經(jīng)統(tǒng)計分 析比較，顯著性P〈〇. 05時；
[0016] 藥物有效：給藥組細胞硬度較模型組降低，給藥組與模型組細胞硬度經(jīng)統(tǒng)計分析 比較，顯著性P〈〇. 05時。
[0017] 所述步驟a中的細胞培養(yǎng)及造模方法、所述步驟b的檢測方法，均可采用本領(lǐng)域技 術(shù)人員公知的常規(guī)方法實現(xiàn)。
【附圖說明】
[0018] 圖1為三組樣品細胞的表面形貌圖；
[0019] 其中A、B、C依次為A549細胞、經(jīng)TGF-0誘導(dǎo)的A549細胞、經(jīng)TGF-0與NAC共同 處治的A549細胞的70ym范圍內(nèi)AFM偏差圖，a、b、c為每種細胞對應(yīng)的10ym局部微觀形 貌圖。
[0020] 圖2為三組樣品細胞的高斯擬合圖及對應(yīng)力曲線；
[0021] 其中A、B、C分別為A549細胞、經(jīng)TGF-0誘導(dǎo)的A549細胞、經(jīng)TGF-0與NAC共同 處治的A549細胞的高斯擬合圖，a、b、c分別為其相應(yīng)力曲線；
[0022] 圖3為三種標志蛋白免疫熒光結(jié)果圖；
[0023] 其中A為E-cadherin檢測結(jié)果，B為a -SMA檢測結(jié)果，C為vimentin檢測結(jié)果；
[0024] 圖4為三種標志蛋白Western blotting結(jié)果圖；
[0025] 其中A為蛋白條帶結(jié)果圖，B為半定量統(tǒng)計柱形圖，*與對照組比較，P〈0. 05 ;#與 模型組比較，P〈〇. 05 與對照組比較，P〈0. 01 ;##與模型組比較，P〈0. 01。
【具體實施方式】
[0026] 發(fā)明人進一步通過具體實驗來說明本發(fā)明篩選方法。
[0027] 再次重申：以下實驗只是本發(fā)明研制過程中眾多試驗中的舉例性實驗，并未涵蓋 和窮盡了發(fā)明人為本發(fā)明所做的所有實驗，目的僅僅在于用那些數(shù)據(jù)來闡述本發(fā)明評價方 法的直觀性及準確性等。
[0028] 一、基于免疫學(xué)分析的抗肺纖維化模型及陽性藥的抗纖維化活性的確認
[0029] 1、免疫熒光染色檢測觀察肺纖維化標志性蛋白的表達
[0030] (1)實驗方法
[0031] ①樣品制備
[0032] 取對