豬初生重性狀相關(guān)plac1基因分子標(biāo)記的克隆及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于豬分子標(biāo)記制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種與豬初生重性狀相關(guān)PLAC1 基因分子標(biāo)記的克隆及應(yīng)用。所述的分子標(biāo)記從豬PLAC1基因中克隆得到，它包括豬PLAC1 基因編碼區(qū)序列突變位點(diǎn)的檢測(cè)方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在養(yǎng)豬生產(chǎn)過(guò)程中，如何達(dá)到使母豬多產(chǎn)以及仔豬多活、快長(zhǎng)從而提高生產(chǎn)性能、 降低生產(chǎn)成本成了養(yǎng)豬生產(chǎn)者關(guān)注的焦點(diǎn)，因此豬繁殖性狀越來(lái)越受到人們的重視。
[0003] 豬的初生重作為一個(gè)重要的繁殖性狀，對(duì)豬出生后的生長(zhǎng)速度及成活率具有重要 的作用。最近有很多文獻(xiàn)報(bào)道了初生重對(duì)豬出生后生長(zhǎng)速度的影響。Beaulieu等（Beaulieu AD等，Impactofpigletbirthweight,birthorderandlittersizeonsubsequent growthperformance,carcassquality,musclecompositionandeatingqualityof pork[J].JAnimSci. 2010)和Poore等（PooreK.R?等，Theeffectsofbirthweight andpostnatalgrowthpatternsonfatdepthandplasmaleptinconcentrationsin juvenileandadultpigs.J.Physiol. 2004)研宄發(fā)現(xiàn)，初生重較低的豬生長(zhǎng)速度較慢，從 而使其進(jìn)入市場(chǎng)的時(shí)間增加。另有研宄表明仔豬的初生重與育成率亦悉悉相關(guān)，初生重在 1.OKg以下時(shí)仔豬育成率隨著初生重的增加而上升；初生重在1.OKg以上時(shí)仔豬育成率沒(méi) 有明顯的規(guī)律。初生重小于等于〇.5Kg時(shí)仔豬育成率僅為55. 56% (高建國(guó).二花臉豬初生 重對(duì)出生后生長(zhǎng)速度及育成率的影響[J].畜牧與獸醫(yī)，1992,24(1) :26)，G〇ndret，F(xiàn).L.等 (Gondret,F.L?等，Lowbirthweightisassociatedwithenlargedmusclefiberarea andimpairedmeattendesnessofthelongissimusmuscleinpigs.J.Anim.Sci. 2006) 和Wolter等（Wolter,B.F?等Theeffectofbirthweightandfeedingofsupplement milkreplacertopigletsduringlactationonpreweaningandpostweaninggrowth performanceandcarcasscharacteristic.J.Anim.Sci. 2002)研宄報(bào)道稱，豬出生重與 出生后早期的生長(zhǎng)速度相關(guān)，初生重小的胎兒初生重大的胎兒更虛弱，出生后需要更好地 環(huán)境條件來(lái)保證它的存活。
[0004] 胎盤是保證胎兒健康發(fā)育的重要場(chǎng)所，母體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)都要通過(guò)胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)給胎兒。 豬胎盤是上皮絨毛膜型胎盤，胎兒側(cè)的胎盤滋養(yǎng)層上皮不會(huì)嵌入母體子宮內(nèi)膜基質(zhì)內(nèi)，而 是與子宮腔上皮相互粘附，并隨著妊娠的進(jìn)行形成裙皺（Miles,J.R.等Molecularcloning andcharacterisationofheparanasemRNAintheporcineplacentathroughout gestation.ReprodFertilDev. 2009)。胎盤裙皺的形成與發(fā)育可以大大增加母體與胎兒 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換的面積，即增加胎盤傳輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的效率（Vallet，J.等Developmentofthe pigplacenta.SocReprodFertilSuppl.2009 ;Linjun,H?等ExpressionofHeparanase IsAssociatedwithBreed-SpecificMorphologicalCharactersofPlacentalFolded BilayerBetweenYorkshireandMeishanPigs.BiolReprod. 2014)，而充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 是保證胎兒健康發(fā)育的基礎(chǔ)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給不足會(huì)導(dǎo)致胎兒發(fā)育遲緩，并降低胎兒的初生 重，嚴(yán)重者甚至?xí)?dǎo)致胎兒死亡。因此胎盤褶皺的形成與發(fā)育對(duì)胎兒初生重具有重要影響。
[0005] PLAC1基因是在人、小鼠等哺乳動(dòng)物胎盤中特異表達(dá)的基因，近期的研宄表明 PLAC1基因在妊娠過(guò)程中對(duì)胎盤滋養(yǎng)層上皮細(xì)胞的迀移、運(yùn)動(dòng)具有重要作用（Wen-Lin，C. 等Roleofplacenta-specificprotein1inthetrophoblastsinvasionand migration.Reproduction. 2014)，從而增大滋養(yǎng)層與母體子宮接觸的面積，增加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 的運(yùn)輸，有利于胎兒健康發(fā)育。另外有研宄發(fā)現(xiàn)，敲除PLAC1基因會(huì)導(dǎo)致胎盤肥大和胎兒宮 內(nèi)發(fā)育遲緩（IUGR)，胎兒往往于妊娠后期或分娩后不久死亡，說(shuō)明PLAC1基因是正常的胎 盤和胚胎發(fā)育所必需的（Jackman,S.M?等Placl(Placenta-specific1)IsEssentialfor NormalPlacentalandEmbryonicDevelopment.MolReprodDev. 2012)〇
[0006] 常規(guī)的育種技術(shù)對(duì)豬繁殖性狀的改良進(jìn)展緩慢，效果不明顯，而且選擇過(guò)程花費(fèi) 時(shí)間長(zhǎng)，耗費(fèi)資金多，準(zhǔn)確性有待提高（Linville，R.C.等Candidategeneanalysisfor lociaffectinglittersizeandovulationrateinswine.JAnimSci. 2001) 〇 分子 生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展使得豬的育種工作出現(xiàn)了新的曙光，目前，標(biāo)記輔助選擇（MAS)已 經(jīng)成功應(yīng)用到國(guó)內(nèi)外的豬育種實(shí)踐中，取得了巨大的經(jīng)濟(jì)效益，憑借這一技術(shù)手段，育種工 作者們發(fā)掘出了一大批與豬的初生重，生長(zhǎng)速度，斷奶重，產(chǎn)仔數(shù)等重要的繁殖性狀有著顯 著關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記。這為提高豬的生產(chǎn)性能提供了理論依據(jù)，并從實(shí)質(zhì)上使之得到了很大 的提尚。
[0007] 鑒于PLAC1基因在妊娠過(guò)程中對(duì)胎盤滋養(yǎng)層上皮細(xì)胞的迀移發(fā)揮重要作用，我們 認(rèn)為它很可能在豬妊娠過(guò)程中對(duì)胎盤滋養(yǎng)層上皮細(xì)胞參與形成胎盤褶皺發(fā)揮著重要作用， 進(jìn)而影響豬胎盤對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸效率，從而對(duì)胎兒初生重具有重要影響。研宄基因突變 位點(diǎn)在群體中的多態(tài)性，并對(duì)其進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析是研宄基因功能的一個(gè)非常有力的手 段，所以申請(qǐng)人對(duì)這個(gè)基因進(jìn)行了多態(tài)性研宄和關(guān)聯(lián)分析，以期能夠發(fā)現(xiàn)它對(duì)豬繁殖性狀 的影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 發(fā)明的目的在于獲得一種與豬初生重性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，克隆PLAC1基因編碼 區(qū)序列，尋找突變位點(diǎn)以及基因多態(tài)性的檢測(cè)方法，為豬初生重性狀檢測(cè)提供一種分子標(biāo) 記和方法。
[0009] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0010] 一種分子標(biāo)記Hhal-RFLP在豬初生重性狀關(guān)聯(lián)分析中的應(yīng)用，其步驟如下所述：
[0011] 1)用人PLAC1基因cDNA為信息探針，作同源序列篩選，獲得同源性高的表達(dá)序 列標(biāo)簽（EST)，然后對(duì)EST進(jìn)行拼接；提取豬妊娠95天胎盤組織總RNA并做cDNA第一鏈 反轉(zhuǎn)錄；設(shè)計(jì)引物對(duì)，該引物對(duì)的正向引物為5 ' -TCCTCTTCCGCCAATCCC-3 '，反向引物為 5' -GCCATCAGAAAITTAmTCTCTC-3'（見(jiàn)序列表SEQIDNO:5,6)，用RT-PCR方法擴(kuò)增豬 PLAC1基因的cDNA片段，PCR產(chǎn)物純化克隆和測(cè)序，通過(guò)序列分析獲得如SEQIDN0:2所示 的核苷酸序列（即cDNA序列）；
[0012] 2)根據(jù)SEQIDNO:2所示的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物對(duì)，該引物對(duì)的核 苷酸序列如下所示：正向引物-CTGCTACGACGTGTTCACCTT-3 '，反向引物： 5 ' -AGCACAGGCTACCCATAAGAG-3 '(見(jiàn)序列表SEQIDNO:3,4)，擴(kuò)增豬基因組DNA，將PCR 產(chǎn)物純化克隆和測(cè)序，通過(guò)序列分析獲得如下所述的核苷酸序列：
[0013] CTGCTACGACGTGTTCACCTTGTCTCAGGCCGGCCGAAGGCCCACCTGCCACTGTCCGCCCTATGTC TTCAGRGCAGGCGGGCGTACTTAGCCCTGCGGGCCCAGGCGGGGGCTCGGGAGGGCCACCTGTGCAGTAGTCTTC CTTCCTTTATACTTCTGACGATGAATCTCTTCTCTCGGGTGATCTGGCTGAGTCCAGGGATCCCCGGGCTTGGGG GGCTCCTGTACTTGCCCTTTCTGAAATTGGTATATACTAGGGACTAATCCGTGCTCTTGTGGCCCTCTTATGGGT AGCCTGTGCT
[0014] 上述序列中的R是C或T，導(dǎo)致Hhal-RFLP多態(tài)性；
[0015] 3)檢測(cè)目的基因PLAClmRNA在豬胎盤的絨毛膜組織樣中轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，設(shè)計(jì)用 于檢測(cè)目的基因PLAClmRNA表達(dá)水平的引物對(duì)以及作為內(nèi)參基因GAPDH的引物對(duì)，其核苷 酸序列分別如下所示：
[0016] 擴(kuò)增目的基因PLAC1的引物對(duì)：
[0017] 正向引物：5'GAAACCTCCACCAGACAGC3'，（見(jiàn)序列表SEQIDNO:7)
[0018] 反向引物：5'CCGTGACCATGAGCCAGT3'，（見(jiàn)序列表SEQIDNO:8)
[0019] 擴(kuò)增內(nèi)參基因GAPDH的引物對(duì)的DNA序列如下：
[0020] 正向引物：5'CACCAGGGCTGCTITTAACTCTG3'，（見(jiàn)序列表SEQIDNO:9)
[0021] 反向引物：5'GATGACAAGCTTCCCGITCTCC3' ；（見(jiàn)序列表SEQIDN0:10)
[0022] 4)PLAC1基因組織表達(dá)譜分析；
[0023] 5)定位PLAC1基因的mRNA在豬胎盤組織的表達(dá)位置；
[0024] 6)應(yīng)用PCR-RFLP方法對(duì)序列表SEQIDNO: 1的第73位堿基進(jìn)行檢測(cè)，然后進(jìn)行 基因型與豬初生重性狀的關(guān)聯(lián)分析。
[0025] SNP發(fā)現(xiàn)與檢測(cè)方法建立：申請(qǐng)人設(shè)計(jì)了擴(kuò)增包含該SNP的引物，經(jīng)分析T/C位點(diǎn) 的突變可以采用Hhal進(jìn)行酶切檢測(cè)多態(tài)性。在擴(kuò)增的302bp的片段上，存在一個(gè)Hhal的酶 切位點(diǎn)，電泳檢測(cè)結(jié)果顯示在PLAC1基因的T/C位點(diǎn)存在3中基因型，CC型（228bp、74bp)， TC型（302bp、228bp、74bp)，TT型（302bp)。酶切電泳結(jié)果證實(shí)了PLAC1基因CDS區(qū)該突變 位點(diǎn)的存在。
[0026] 同時(shí)通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)了PLAC1基因在大白豬妊娠的第26天、50天和95天胎 盤組織樣中轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況，結(jié)果表明（如圖3所述），PLAC1基因在胎盤褶皺形成初 期（妊娠26天）表達(dá)量較低，隨著妊娠的進(jìn)行，表達(dá)量逐漸增高，在妊娠末期（妊娠95天） 仍具有較高的表達(dá)量。組織表達(dá)譜結(jié)果表明PLAC1基因只在豬胎盤組織中特異表達(dá)（如圖 4所述）。另外通過(guò)原位雜交實(shí)驗(yàn)表明PLAC1基因mRNA只在胎盤滋養(yǎng)層上皮細(xì)胞中表達(dá)， 在胎盤基質(zhì)細(xì)胞以及子宮中都不表達(dá)，其雜交模式在梅山與大白豬中沒(méi)有顯著區(qū)別（圖5 所示）。由雜交信號(hào)的強(qiáng)弱程度可以看出，在妊娠26天，PLAC1基因mRNA的雜交信號(hào)較弱， 表明其表達(dá)量較低，而在妊娠50天和95天雜交信號(hào)都很強(qiáng)，表明其表達(dá)量在這兩個(gè)時(shí)期都 很強(qiáng)，這與定量的結(jié)果相一致。PLAC1基因在豬胎盤組織中的時(shí)期特異性表達(dá)說(shuō)明其在胎盤 發(fā)育及功能中有重要作用，很可能與促進(jìn)豬胎盤褶皺的發(fā)育有關(guān)。
【附圖說(shuō)明】
[0027] 序列表SEQIDNO:1是本發(fā)明制備的分子標(biāo)記的核苷酸序列，序列全長(zhǎng)為302bp， 在該序列的第73bp處有一個(gè)C/T突變，該突變導(dǎo)致Hhal-RFLP多態(tài)性（其中序列表SEQID NO:1中73bp處的堿基已經(jīng)由C突變?yōu)門)。
[0028] 序列表SEQIDNO:2是擴(kuò)增的PLAC1基因的cDNA序列，序列全長(zhǎng)為1106bp。
[0029] 序列表SEQIDNO:3-10是設(shè)計(jì)的引物序列（這些引物序列與說(shuō)明書正文中的序 列說(shuō)明是一致的）。
[0030] 圖1 :是本發(fā)明PLAC1基因的分子標(biāo)記的制備流程圖。
[0031] 圖2 :本發(fā)明中豬PLAC1基因用于PCR-RFLP檢測(cè)的DNA片段，即本發(fā)明制備的分 子標(biāo)記（下劃線部分為引物