雙熒光報(bào)告系統(tǒng)在腫瘤干細(xì)胞靶向性藥物篩選中的應(yīng)用及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及雙熒光報(bào)告系統(tǒng)在腫瘤干細(xì)胞靶向性藥物篩 選中的應(yīng)用及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗腫瘤新藥的市場(chǎng)需求大、社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益大，國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥行業(yè)一直把抗腫瘤藥 物作為新藥研發(fā)的重中之重。目前全球共有至少860種抗腫瘤藥物正處于臨床試驗(yàn)階段。 這一數(shù)字是處于臨床試驗(yàn)階段的心臟疾病和中風(fēng)類藥物總和的兩倍，也是阿爾茨海默病和 其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病類藥物總和的兩倍。然而目前藥物的篩選均是以腫瘤細(xì)胞群體作為考 察對(duì)象，而近年的研宄指向腫瘤中腫瘤干細(xì)胞（CancerStemCells，CSCs)的存在是腫瘤 惡性表現(xiàn)的內(nèi)在支撐，體現(xiàn)在：CSCs形成于腫瘤早期甚至癌前病變，始動(dòng)腫瘤發(fā)生和演進(jìn)； CSCs具有多向分化潛能，是腫瘤成分多樣性和分化異質(zhì)性的原因；CSCs具有高侵襲性，是 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的主要細(xì)胞，是轉(zhuǎn)移的"源泉";CSCs抵抗化療和放療，是腫瘤復(fù)發(fā)的根源； CSCs還能始動(dòng)和促進(jìn)血管生成，通過分泌血管生成因子、轉(zhuǎn)分化為內(nèi)皮以及形成血管擬態(tài) 為腫瘤提供營(yíng)養(yǎng)；通過免疫編輯，CSCs具有抑制免疫細(xì)胞（DC、T、NK細(xì)胞）并參與腫瘤免疫 逃逸機(jī)制的形成。因此篩選靶向CSCs的治療藥物已被認(rèn)為是未來腫瘤綜合治療很有希望 的有效策略之一。
[0003] 目前CSCs藥物篩選方面存在很多限制，主要體現(xiàn)在一方面CSCs難以獲得，另一方 面CSCs獲得以后，在藥物篩選過程中會(huì)有部分細(xì)胞自發(fā)分化轉(zhuǎn)變?yōu)榉荂SCs，因此如果此時(shí) 以細(xì)胞群體作為對(duì)象則評(píng)價(jià)結(jié)果不可靠，而再次使用抗體等方法對(duì)CSCs進(jìn)行標(biāo)記區(qū)分則 費(fèi)事費(fèi)力，不但無法大規(guī)模開展，也會(huì)增加系統(tǒng)誤差，影響評(píng)價(jià)結(jié)果。
[0004] 本實(shí)驗(yàn)前期研宄表明Nanog可以作為肝癌干細(xì)胞的新標(biāo)記物分子，也就 是說，Nanog陰性細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镹anog陽(yáng)性細(xì)胞即意味著肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楦伟└杉?xì)胞 Ofepatology. 2012, 56 (3) : 1004-14)，本發(fā)明擬在上述研宄的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步建立腫瘤干細(xì) 胞的藥物篩選方法，為研宄新型抗腫瘤藥物提供新思路。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種雙熒光報(bào)告系統(tǒng)，并提供了該報(bào)告系統(tǒng)在腫瘤干細(xì)胞 靶向性藥物篩選中的應(yīng)用，通過此雙熒光報(bào)告系統(tǒng)能夠?qū)δ[瘤干細(xì)胞進(jìn)行靶向性藥物篩 選；本發(fā)明同時(shí)還提供了藥物篩選的具體方法。
[0006] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案具體如下：
[0007] 1、用于腫瘤干細(xì)胞藥物篩選的雙熒光報(bào)告系統(tǒng)，所述雙熒光報(bào)告系統(tǒng)包括熒光報(bào) 告系統(tǒng)I和焚光報(bào)告系統(tǒng)II;所述焚光報(bào)告系統(tǒng)I由腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記分子的基因啟動(dòng)子啟 動(dòng)表達(dá)。
[0008] 優(yōu)選的，所述標(biāo)記分子為Nanog。
[0009] 優(yōu)選的，所述熒光報(bào)告系統(tǒng)II由組成型啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)。
[0010] 優(yōu)選的，所述熒光報(bào)告系統(tǒng)II由持家基因的啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)。
[0011] 優(yōu)選的，所述熒光報(bào)告系統(tǒng)II由細(xì)胞內(nèi)持家基因磷酸甘油酸激酶的啟動(dòng)子啟動(dòng)表 達(dá)。
[0012] 優(yōu)選的，所述雙焚光報(bào)告系統(tǒng)為雙焚光報(bào)告載體，其中，焚光報(bào)告系統(tǒng)I和焚光報(bào) 告系統(tǒng)II位于同一載體；所述熒光報(bào)告系統(tǒng)I為綠色熒光蛋白GFP基因的編碼區(qū)，所述熒 光報(bào)告系統(tǒng)II為紅色熒光蛋白FP635基因的編碼區(qū)。
[0013] 優(yōu)選的，所述腫瘤干細(xì)胞為肝癌干細(xì)胞。
[0014] 優(yōu)選的，所述肝癌干細(xì)胞為Huh7細(xì)胞。
[0015] 2、上述雙熒光報(bào)告系統(tǒng)在腫瘤干細(xì)胞藥物篩選中的應(yīng)用。
[0016] 3、采用上述雙熒光報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)行腫瘤干細(xì)胞藥物篩選的方法，先用包含雙熒光報(bào) 告系統(tǒng)的病毒感染腫瘤細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度達(dá)到40-80%后加入藥物 繼續(xù)培養(yǎng)；培養(yǎng)完畢后，加入細(xì)胞核染料對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行標(biāo)記；根據(jù)單獨(dú)分布的散在細(xì)胞確 定檢測(cè)細(xì)胞的直徑范圍；用高內(nèi)涵成像系統(tǒng)檢測(cè)綠色熒光和紅色熒光蛋白的表達(dá)情況，通 過統(tǒng)計(jì)單位面積內(nèi)紅色熒光蛋白和綠色熒光蛋白的表達(dá)情況評(píng)估藥物對(duì)腫瘤干細(xì)胞的殺 傷效果。
[0017] 本發(fā)明的有益效果在于：通過使用紅色和綠色熒光蛋白對(duì)群體腫瘤細(xì)胞和腫瘤干 細(xì)胞分別進(jìn)行標(biāo)記，利用高內(nèi)涵成像系統(tǒng)即可評(píng)估藥物分別對(duì)腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞的靶 向性。由圖3可知，本發(fā)明所述方法能夠分別將腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記為紅色和綠色 熒光，提示本發(fā)明所述方法能夠用于藥物篩選，而實(shí)施例3所述實(shí)驗(yàn)證實(shí)本發(fā)明確實(shí)能夠 用于腫瘤藥物的篩選。由于目前還沒有很好的靶向腫瘤干細(xì)胞的藥物篩選方法，本發(fā)明建 立的腫瘤干細(xì)胞篩選方法可望用于針對(duì)腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行新型抗腫瘤藥物的篩選，從而提高 抗腫瘤藥物的篩選效果。
【附圖說明】
[0018] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0019] 圖1為L(zhǎng)v-PhrcK-FP635載體的結(jié)構(gòu)及關(guān)鍵限制性酶切位點(diǎn)的分布示意圖，該載體中 hPGK啟動(dòng)子以及紅色熒光蛋白FP635基因開放閱讀框順序相連，可將病毒感染的細(xì)胞標(biāo)記 上紅色焚光。
[0020] 圖2為L(zhǎng)v-PN_g-GFP-PhrcK-FP635載體的結(jié)構(gòu)及關(guān)鍵限制性酶切位點(diǎn)的分布示意 圖，該載體中Nanog啟動(dòng)子、綠色熒光蛋白GFP基因開放閱讀框、hPGK啟動(dòng)子以及紅色熒光 蛋白FP635基因開放閱讀框順序相連。
[0021] 圖3為將Lv-PN_g-GFP-PhrcK-FP635載體包裝成慢病毒，并感染人肝癌細(xì)胞Huh7， 感染后72h拍攝的熒光照片；其中A圖表示細(xì)胞中紅色熒光的表達(dá)情況；B圖表示綠色熒光 蛋白的表達(dá)情況；C圖表示相應(yīng)明場(chǎng)的圖片；D圖紅色熒光、綠色熒光以及明場(chǎng)的疊合圖。圖 片放大倍數(shù)為100倍。
[0022] 圖4為感染有Lv-PN_g-GFP慢病毒的人肝癌細(xì)胞Huh7,分別用不同濃度的藥物 Sorafinib和Verapamil，以及兩種聯(lián)合處理的情況下，用MD的高內(nèi)涵成像系統(tǒng)對(duì)每個(gè)處理 組拍攝3X3總計(jì)9個(gè)視野，圖片為系統(tǒng)自動(dòng)拼合的圖片。其中A圖表示不同處理情況下 GFP的表達(dá)情況；B圖表示用DAPI染色的細(xì)胞核情況；C圖為A和B的疊合圖。
[0023] 圖5為MD的高內(nèi)涵成像系統(tǒng)依據(jù)細(xì)胞GFP的熒光強(qiáng)度自動(dòng)分析處理結(jié)果。其中 A圖為拍攝的原始圖片；B圖為細(xì)胞核著色情況；C圖為系統(tǒng)依據(jù)設(shè)定的GFP表達(dá)閾值將處 在閾值以上的細(xì)胞核標(biāo)記出來；D圖為系統(tǒng)自動(dòng)處理后，能準(zhǔn)確識(shí)別出GFP陽(yáng)性細(xì)胞。
[0024] 圖6為依據(jù)高內(nèi)涵系統(tǒng)分析結(jié)果，分別得到的Sorafinib和Verapamil藥物處理 情況下，細(xì)胞中GFP平均熒光強(qiáng)度的時(shí)間變化曲線，可以據(jù)此判斷藥物對(duì)細(xì)胞GFP表達(dá)的改 變情況，從而評(píng)估藥物對(duì)GFP所表示的腫瘤干細(xì)胞特性的影響能力。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 本發(fā)明以肝癌細(xì)胞為例，進(jìn)一步闡述發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，然而需要指出的是，本 發(fā)明所述技術(shù)方案不僅僅局限于肝癌細(xì)胞，亦可稍加改變而用于其它腫瘤細(xì)胞。
[0026] 本實(shí)驗(yàn)前期通過感染Lv-PN_g-GFP慢病毒的方式對(duì)肝癌細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，從而 可以用感染Lv-PN_g-GFP慢病毒后表現(xiàn)為GFP(綠色熒光蛋白）不表達(dá)的肝癌細(xì)胞表 示Nanog陰性細(xì)胞，而用GFP表達(dá)的肝癌細(xì)胞表示Nanog陽(yáng)性細(xì)胞（Hepatology. 2012， 56(3) : 1004-14)。
[0027] 本發(fā)明所用肝癌細(xì)胞系為Huh7細(xì)胞，Huh7細(xì)胞來源于本課題組庫(kù)存。
[0028] 本發(fā)明所用分選型和分析型流式細(xì)胞儀均購(gòu)自BD公司；光學(xué)顯微鏡、倒置顯微鏡 和倒置焚光顯微鏡均購(gòu)自O(shè)lympus公司；高內(nèi)涵成像系統(tǒng)購(gòu)自MD公司。
[0029] 本發(fā)明所用Hoechst33342購(gòu)自碧云天公司；B27Supplement購(gòu)自Gibco公 司；pTurboFP635-N質(zhì)粒購(gòu)自Evrogen公司（CAT:FP722);rTaq酶購(gòu)自TaKaRa公司； pMD-19-T-Simple載體購(gòu)自TaKaRa公司（CAT:D104A) ;pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE質(zhì)粒 購(gòu)自八(1(^6116公司化41':12252，完整序列見5￡〇10此.4)$1'-(3(^6??質(zhì)粒為南京金斯瑞 公司合成后本研宄室保存，該克隆載體含有GFP編碼基因，合成后即連接在克隆載體T載體 上；CutSmart?Buffer為NEB公司生產(chǎn)；Sorafinib購(gòu)自SantaCruz公司；Verapamil購(gòu)自 SantaCruz公司。
[0030] 本發(fā)明主要細(xì)胞培養(yǎng)試劑及溶液配制如下：
[0031] (l).DMEM培養(yǎng)基：將DMEM粉末溶于超純水中，每升加入青霉素0.0625g、鏈霉素 0?llg、NaHC033. 73g和HEPES5. 96g，攪拌至完全溶解，用 10mol/LNaOH將pH調(diào)至7. 2-7. 4， 0. 22ym濾膜過濾除菌，4°C保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r(shí)每瓶按10%體積加入FBS，即為完全培養(yǎng)基。
[0032](2).磷酸鹽緩沖液（0. 01mol/LPBS):取PBS袋裝粉劑（2L裝），用約1L超純水 溶解，充分?jǐn)嚢柚?