用于滅活病毒以及其他外源性因子的方法
【專利說明】用于滅活病毒以及其他外源性因子的方法
[0001] 相關申請的交互引用
[0002] 本申請要求2013年3月15日提交的美國專利申請?zhí)?3/844,051和2012年6月 20日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/662, 349的優(yōu)先權，將所述專利以其整體并入本文作 為參考。 發(fā)明領域
[0003] 本發(fā)明提供了使用高溫瞬時（HTST)處理以及調整多種參數以使沉淀物的產生和 沉積減少和/或最小化的病毒滅活方法。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 病毒在藥物生產工藝中是潛在的污染物，特別是在生物藥物來源于哺乳動物細胞 培養(yǎng)物的情況下。病毒污染物的來源可以是用于細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基或者產生目的生物制 品的細胞系。目前在生產工藝期間防止病毒污染生物藥物的方法包括用于滅活病毒的高 溫瞬時（HTST)細胞培養(yǎng)基處理，所述病毒可能通過原材料引入到細胞培養(yǎng)基中并在培養(yǎng) 過程中擴增（Schleh，M.等人 2009. Biotechnol. Prog. 25(3) :854-860 和 Kiss, R. 2011. PDA J Pharm Sci and Tech. 65:715-729)。已經報道，對于HTST所需的約85°C以上的溫度是 有效的病毒滅活方法，其中對于滅活細小病毒，需要約95°C以上的溫度，所述細小病毒是已 記錄的在細胞培養(yǎng)過程中存在的常見細胞培養(yǎng)病毒污染，并且其抗許多化學和物理滅活劑 (inactivating agent) (Schleh 等人）。
[0006] 盡管在病毒的滅活中已經證實HTST處理是高度有效的，但當進行該處理時，在多 種細胞培養(yǎng)基中會產生沉淀或生成沉淀物。該沉淀導致殘渣在HTST系統(tǒng)內的表面上積累 并引起設備結垢，以使其不再能將培養(yǎng)基加熱至完全滅活病毒污染物的目標溫度。此外，該 沉淀還可能使濾器結垢，該濾器通常在HTST系統(tǒng)的下游使用的用于去除來自培養(yǎng)基的微 生物如細菌的最終處理。該濾器結垢可能導致不能完成細胞培養(yǎng)工藝之前的培養(yǎng)基處理步 驟。在一些實例中，沉淀物還可能影響細胞培養(yǎng)基的性能，并妨礙來自培養(yǎng)的細胞系的生物 藥物的高效產生。為了防止沉淀，可以降低溫度，但可能會不利地影響成功的病毒滅活。此 夕卜，HTST細胞培養(yǎng)基處理期間的沉淀生成可能導致在生產工藝期間頻繁地清潔或維護用于 HTST處理的設備，這顯著增加了工藝的成本。因此，在去除或滅活病毒污染物的HTST處理 期間存在防止沉淀生成，并且不會不利地影響該處理的效率的需求。
[0007] 本文中所述的發(fā)明通過使用HTST處理，提供在細胞培養(yǎng)基中有效滅活病毒污染 物的方法，從而滿足了這些需求，所述HTST處理調整了導致沉淀生成減少或防止沉淀生成 的工藝參數。
[0008] 本文中所引用的全部參考文獻，包括專利申請和出版物在此處以其整體并入本文 作為參考。
[0009] 發(fā)明概述
[0010] 本發(fā)明通過使用高溫瞬時（HTST)處理并調整培養(yǎng)基中多種參數如pH和/或鈣和 /或磷酸鹽濃度組合，提供了用于滅活細胞培養(yǎng)基中的病毒污染物和/或其他污染物的方 法、工藝、系統(tǒng)和組合物。此外，還提供了減少用于HTST處理的設備和濾器結垢的方法、工 藝、系統(tǒng)和組合物。
[0011] 因此，在一個方面，本發(fā)明提供了用于在細胞培養(yǎng)基中滅活病毒或外源性因子 (adventitious agent)，同時使所述培養(yǎng)基維持細胞培養(yǎng)適合性的方法，所述方法包括（a) 將細胞培養(yǎng)基進行高溫瞬時（HTST)處理，和（b)調整選自pH、鈣水平和磷酸鹽水平的一個 或多個參數。
[0012] 在其他方面，本發(fā)明提供了用于在細胞培養(yǎng)基中滅活病毒的方法，其包括將細胞 培養(yǎng)基進行高溫瞬時（HTST)處理，其中培養(yǎng)基在HTST處理期間具有約pH5. 0至約pH6. 9之 間的pH。在另一方面，本發(fā)明提供了用于在細胞培養(yǎng)基中滅活病毒的方法，其包括將細胞培 養(yǎng)基進行高溫瞬時（HTST)處理，其中培養(yǎng)基在HTST處理期間具有約pH5. 0至約pH7. 2之 間的pH。在一些實施方案中，培養(yǎng)基在HTST處理期間具有約pH5. 3至約pH6. 3之間的pH。 在其他實施方案中，培養(yǎng)基在HTST處理期間具有約pH6. 0的pH。在任一實施方案中，HTST 處理包括將培養(yǎng)基的溫度升高至至少約85°C并持續(xù)足夠的時間，以滅活培養(yǎng)基中的病毒或 可能的病毒。在一些實施方案中，將培養(yǎng)基的溫度升高至至少約93°C并持續(xù)足夠的時間，以 滅活培養(yǎng)基中的病毒或可能的病毒。在一些實施方案中，將培養(yǎng)基的溫度升高至至少約95、 97、99、101或103°C并持續(xù)足夠的時間，以滅活培養(yǎng)基中的病毒或可能的病毒。在一些實施 方案中，在多肽產生階段之前，在HTST處理期間將培養(yǎng)基的pH降低至約pH5. 0至約pH6. 9 之間。在一些實施方案中，然后使培養(yǎng)基的pH達到約6. 9-7. 2之間，以用于多肽產生階段。
[0013] 在另一方面，本發(fā)明提供了在細胞培養(yǎng)基中滅活病毒的方法，包括在HTST處理期 間將培養(yǎng)基中磷酸鹽和鈣的總量限制至小于約10mM。在一些實施方案中，在HTST處理期 間將培養(yǎng)基中磷酸鹽和鈣的總濃度限制至約小于9、8、7、6、5、4、3、2或ImM。在一些實施方 案中，在多肽產生階段之前，在HTST處理期間將培養(yǎng)基中磷酸鹽和鈣的總量限制至小于約 10mM。在一些實施方案中，在蛋白質產生階段，然后將培養(yǎng)基中磷酸鹽和鈣的總量升高至足 夠多肽產生的水平。
[0014] 在另一方面，本發(fā)明提供了減少用于HTST處理的設備結垢的方法，該方法包括將 在設備中使用的細胞培養(yǎng)基進行高溫瞬時（HTST)處理，其中培養(yǎng)基在HTST處理期間具有 約pH5. 0至約pH6. 9之間的pH。在一些實施方案中，在HTST處理期間，培養(yǎng)基具有約pH5. 3 至約pH6. 3之間的pH。在一些實施方案中，在HTST處理期間，培養(yǎng)基具有約pH6. 0的pH。 在一些實施方案中，污垢包含用于HTST處理的設備上的沉淀。在任意實施方案中，HTST處 理包括將培養(yǎng)基的溫度升高至至少約85°C并持續(xù)足夠的時間，以滅活培養(yǎng)基中的病毒。在 一些實施方案中，將培養(yǎng)基的溫度升高至至少約95、97、99、101或103°C并持續(xù)足夠的時 間，以滅活培養(yǎng)基中的病毒。
[0015] 在另一方面，本發(fā)明提供了減少用于HTST處理的設備結垢，以滅活病毒的方法， 該方法包括在HTST處理期間，將設備中使用的培養(yǎng)基中的磷酸鹽和鈣的總量限制至小于 約10mM。在一些實施方案中，將HTST處理期間，培養(yǎng)基中磷酸鹽和鈣的總濃度限制至小于 約9、8、7、6、5、4、3、2或ImM。在一些實施方案中，污垢包含用于HTST處理的設備上的沉淀。 在任一實施方案中，病毒選自細小病毒科（parvoviridae)、paramyoxviridae、正粘病毒科 (orthomyxoviridae)、布尼亞病毒科（bunyaviridae)、彈狀病毒科（rhabdoviridae)、呼腸 孤病毒科（reoviridae)、披膜病毒科（togaviridae)、杯狀病毒科（caliciviridae)和小 RNA病毒科（picornaviridae)。在任一實施方案中，病毒是有包膜病毒。在任一實施方案 中，病毒是無包膜病毒。
[0016] 附圖簡述
[0017] 圖1是在生產中使用的代表性HTST skid的示意圖。
[0018] 圖2是描述用沙浴法和HTST處理至102°C目標設定點的加熱分布圖。軌跡顯示 了以分鐘表示的加熱分布圖，其中通過時間和終點的溫度描述了每一軌跡的終點（例如， "6. 2, 102"的終點值=在6. 2分鐘的終點值為102°C )。
[0019] 圖3是在通過沙浴法熱處理后，在HTST處理期間已知會沉淀的培養(yǎng)基樣品的圖。 A)在熱處理壓力容器中pH 7. 0或pH 6. 4的培養(yǎng)基1和pH 7. 0或pH 6. 7的培養(yǎng)基2的未 離心樣品。B)來自經處理的壓力容器的pH 7.0或pH 6. 4的培養(yǎng)基1和pH 7.0或pH 6. 7 的培養(yǎng)基2的經離心的整分試樣。
[0020] 圖4針對與更高水平的經沙浴處理的樣品渾濁度相關的參數術語，描述了培養(yǎng)基 制劑（基于培養(yǎng)基4)的分類參數估計。
[0021] 圖5是描述沙浴熱處理期間，通過渾濁度測量的沉淀響應面的一系列圖，該渾濁 度來自基于培養(yǎng)基4制劑的3方面（不同的鈣、磷酸鹽和pH水平）。每一網格可見的透視 平面部分顯示了渾濁度低于5NTU的區(qū)域，其與測試的培養(yǎng)基樣品中不可見的沉淀相關并 代表了安全操作方案。A)側視圖，顯示具有不同濃度的磷酸鹽和鈣的培養(yǎng)基中的渾濁度測 量。俯視圖顯示培養(yǎng)基中的渾濁度測量，其中B)具有不同濃度的磷酸鹽和鈣，C)具有不同 的磷酸鹽濃度和pH水平，以及D)不同的鈣濃度和pH水平。
[0022] 圖6是就已知的和估計的鈣和磷酸鹽濃度而言，描述位于pH 7. 0的培養(yǎng)基4響應 面上的培養(yǎng)基制劑的圖。盡管全部制劑中的其他組成有差異，但鈣和磷酸鹽濃度與熱處理 后可能的沉淀強烈相關。箭頭指由于添加了含另外水平的磷酸鹽和/或鈣的水解產物，培 養(yǎng)基移位到了沉淀方案（precipitation regime)。
[0023] 圖7描述了在沙浴系統(tǒng)中四種培養(yǎng)基制劑的平均加熱分布圖。獲取了了五種不同 的溫度終點（通過兩個數字表示，例如"2. 5, 75. 9" =在2. 5分鐘獲取樣品，產生了 75. 9°C 的平均溫度）。右邊照片中將在未離心和離心樣品中觀察到的可見沉淀相關的實心圓或空 心圓重疊?？招膱A=在未離心的或離心的樣品中通過目測方法沒有檢測到沉淀。實心圓= 在兩個或一個樣品中通過目測方法檢測到了沉淀。
[0024] 圖8是描述獲自4種不同培養(yǎng)基制劑的5個不同溫度終點樣品的渾濁度（NTU)值 的圖。渾濁度值大于?8NTU與通過直接目測檢查或者離心樣品檢查鑒定的可見沉淀相關。
[0025] 圖9是顯示HTST處理后鐵（左圖）和銅（右圖）損耗的一系列圖，其中HTST加 工和過濾操作都是成功的。
[0026] 圖10是顯示在熱處理期間，由于改變A)pH水平、B)鈣（Ca)濃度、C)磷酸鹽（PO4) 濃度、D)鐵（Fe)濃度和E)銅（Cu)濃度對鐵回收的主效應圖。
[0027] 圖11描述了顯示來自統(tǒng)計學設計實驗（實驗設計（DoE))結果的相互作用圖的一 系列圖，所述統(tǒng)計學設計實驗結果顯示了熱處理期間pH、Ca、P0 4之間和Fe對鐵回收的互作 效應。
[0028] 圖12是顯示在經熱處理的培養(yǎng)基中，最終Fe濃度對初始Fe濃度的依賴性的圖。 全部其他培養(yǎng)基組分都處于正常的I. 5X培養(yǎng)基4水平。
[0029] 圖13是顯示在經熱處理的培養(yǎng)基中，Fe補償對幾種參數的調整的依賴性的圖。在 經熱處理的培養(yǎng)基中，A)Fe回收對pH水平的依賴性，和B)Fe回收對鈣和磷酸鹽的濃度的 依賴性。全部其他培養(yǎng)基組分都處于正常的1.5X培養(yǎng)基4水平。在X軸刻度上，培養(yǎng)基 4的標準濃度通過1表示。
[0030] 圖14是顯示熱處理后，鈣和磷酸鹽回收與Fe回收的關系圖。紅色圓圈內的數據 點指示顯示出可見沉淀和增加的渾濁度（NTU)的樣品。直線表示Fe回收與鈣數據點的關 系。
[0031] 圖15是顯示HTST處理前和后，在多種細胞培養(yǎng)基制劑中鐵水平的圖。對于特定 的細胞培養(yǎng)基（例如，培養(yǎng)基14)，左邊的棒狀圖表示HTST處理后細胞培養(yǎng)基中鐵的期望水 平，中間的棒狀圖表示HTST處理前（HTST前）細胞培養(yǎng)基中鐵的實際水平，右邊的棒狀圖 表示HTST處理后（HTST后）細胞培養(yǎng)基中鐵的實際水平。
[0032] 圖16是顯示將鐵加入經HTST處理的培養(yǎng)基中在細胞培養(yǎng)中對NSO骨髓瘤細胞系 的生長有益的圖。HTST+表示細胞