用于提高飼料品質(zhì)的方法和組合物的制作方法
【專利說明】用于提高飼料品質(zhì)的方法和組合物
[0001] 相關(guān)申請的引用
[0002] 本申請要求2012年6月26日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/664, 359的優(yōu)先權(quán)， 所述申請的全部公開內(nèi)容以引用方式并入本文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及植物基因工程。更確切來說，本發(fā)明涉及用于改善飼料作物營養(yǎng)品質(zhì) 的方法。
[0004] 序列表的并入
[0005] 將電子方式提交并且創(chuàng)建于2013年6月25日的文件名為"MONS336WO_ST25. txt" 的序列表文件以引用方式并入本文，其大小為18千字節(jié)（在Microsoft Windows?中計 算出文件大?。?br>[0006] 發(fā)明背景
[0007] 本發(fā)明通過基因工程來提供方法和組合物，其中轉(zhuǎn)基因苜蓿植物的酸性洗滌木 質(zhì)素（ADL)水平降低，愈創(chuàng)木基木質(zhì)素（G木質(zhì)素）水平降低，中性洗滌纖維消化率水平 (NDFD)提高，并且植物活力與野生型相當(dāng)，這使得農(nóng)業(yè)適應(yīng)性改善。飼料作物（包括豆科 植物、禾本科植物、玉米青IC料和蕓苔屬（brassica)等）在全世界種植以提供具有可消化 纖維的動物飼料。苜蓿和/或苜蓿干草是美國最重要的干草作物。雖然主要作為成捆干草 來飼喂，但是它也可以作為青貯料、碎干草、方粒飼料或顆粒飼料來飼喂。苜蓿（紫花苜蓿 (Medicago sativa))是飼料豆科植物，它占奶牛飼料的23%至34%。優(yōu)質(zhì)苜蓿干草是高度 可消化的并且提供較高的蛋白質(zhì)、能量、維生素和礦物質(zhì)。優(yōu)質(zhì)苜蓿也含較少纖維素和半纖 維素、較少木質(zhì)素、較低纖維和較高相對飼用價值。苜蓿飼用價值常用NDFD來衡量。分析 苜蓿飼料的NDFD可提供奶牛能夠從飼料獲得能量的估計，并且有必要提高苜蓿中的纖維 消化率。例如，提高一個百分比單位的NDFD可使每天攝入的飼料干料提高0. 37鎊，使4% 乳脂校正奶（FCM)產(chǎn)量提高0. 55鎊/天。飼喂具有更高NDFD飼料的奶牛能夠從飼料中獲 得更多的總能量和營養(yǎng)價值。因此，在飲食中提供較少的谷物就能滿足能量需求。飼料豆 科植物中較低的NDFD最常與飼料植物成熟度有關(guān)系，這伴隨有木質(zhì)素濃度的升高并且與 纖維素纖維升高有關(guān)。
[0008] 影響NDFD的因素包括酸性洗滌纖維（ADF)的量。ADF是指飼料的細胞壁部分，它 是飼料最難消化的部分，包括木質(zhì)素、纖維素、二氧化硅和氮的不溶性形式。這些數(shù)值是特 別重要的，因為它們涉及家畜對飼料的消化率。具有較高ADF的飼料與具有較低ADF的飼 料相比消化能較低。因此，隨著ADF水平升高，消化能水平降低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明通過基因工程來提供一種方法和組合物，其中可以選擇具有較高飼用價值 成分的轉(zhuǎn)基因苜蓿植物，如與不包含本發(fā)明的DNA分子的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参锵啾?，ADL和G 木質(zhì)素的濃度降低，下莖部中的NDFD水平升高而活力至少相當(dāng)，以及農(nóng)業(yè)適應(yīng)性。具有較 低木質(zhì)素的苜蓿事件是通過使用RNAi構(gòu)建體下調(diào)木質(zhì)素生物合成酶紫花苜蓿（Medicago sativa) S-腺苷-L-甲硫氨酸：咖啡?；?CoA 3-0-甲基轉(zhuǎn)移酶（CCoAOMT)而產(chǎn)生的。所 有構(gòu)建體都使用了美國專利申請公開2005/0176670中描述的穩(wěn)定反義技術(shù)，以引用方式 并入本文中。選擇較低木質(zhì)素苜蓿的事件的方法是"木質(zhì)素含量的降低，從而在10%開花 成熟階段之前切割時整株植物消化率提高8-15%。所述方法從苜蓿植物種群中選擇苜蓿植 物，其中所述苜蓿植物種群包含與SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2同源或互補的重組DNA分 子。所述方法包括分析苜蓿植物種群的下莖部并且選擇滿足以下條件的植物：與不包含這 些重組DNA分子的苜蓿植物相比時，（1)酸性洗滌木質(zhì)素濃度降低，其中酸性洗滌木質(zhì)素濃 度的降低介于12%和31%之間；(2)愈創(chuàng)木基木質(zhì)素濃度降低，其中所述濃度降低約25% 或更高；（3)中性纖維消化率升高，其中NDFD值升高18%以上。
[0010] 在本發(fā)明的一個方面中，選擇出的具有較高飼用價值成分的苜蓿植物具有大體上 等于不包含所述重組DNA分子的苜蓿植物的活力。
[0011] 在另一個方面中，本發(fā)明提供一種分析和選擇已經(jīng)用咖啡?；鵆oA 3-0-甲基轉(zhuǎn) 移酶（CCoAOMT)的抑制構(gòu)建體（SEQ ID NO:7)轉(zhuǎn)化的具有較高飼用價值成分的轉(zhuǎn)基因苜蓿 植物的方法，它進一步包含維管-增強啟動子（vascular-enhanced promoter)以調(diào)控與 SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2同源或互補的重組DNA分子的轉(zhuǎn)錄。
[0012] 在又一個方面中，本發(fā)明提供通過本發(fā)明方法選擇的苜蓿植物或所述植物的子 代，或來源于所述植物或子代植物的干草或青貯料，其中所述苜蓿植物或植物產(chǎn)品包含與 SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2同源或互補的DNA分子，并且包含由下莖部中較低的ADL和G 木質(zhì)素濃度、較高的NDFD水平帶來的較高飼用價值成分。
[0013] 附圖簡述
[0014] 以下附圖形成本說明書的一部分，并且被包括來進一步說明本發(fā)明的某些方面。 通過參考這些附圖中的一個或多個和以下對它們的相應(yīng)描述并結(jié)合本文中提供的特定實 施方案的詳細描述，可以更好地理解本發(fā)明。
[0015] 圖1-用黑體例示并概述了與非轉(zhuǎn)基因事件相比，具有抑制的咖啡酰基CoA 3-0-甲基轉(zhuǎn)移酶（CCoAOMT)的良種轉(zhuǎn)基因苜蓿事件的ADL濃度介于80%和91%之間；NDFD 值介于110%和125%之間；并且具有較低的G木質(zhì)素值。
[0016] 圖2-例示符合所要求的表現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)的KK179-2的良種事件和木質(zhì)素降低苜蓿事件 (定義為"甜蜜點"），這些標(biāo)準(zhǔn)是以飼料消化率提高和營養(yǎng)品質(zhì)提高的百分比ADL、NDFD和 活力的水平為基礎(chǔ)。
[0017] 序列簡述
[0018] SEQ ID N0:l-CCoA0MT 基因 1139987:1CR-紫花苜蓿 CC〇AOMT-1:1:1 的序列（有義 方向）。
[0019] SEQ ID NO:2-1150536: ICR-蒺藜苜蓿（Medicago truncatula)CCoA0MT-l: 1:2 的 序列（反義方向）。
[0020] SEQIDN0:3-介于有義臂與反義臂之間的RNA環(huán)的序列（374-530bp)。
[0021] SEQ ID N0:4-RNA 環(huán)的 5' 端的序列（7-73bp)。
[0022] SEQ ID NO:5-1141266:1 啟動子（P)-Pv. Pal2-1:1:1 的序列。
[0023] SEQ ID N0:6-1141267:l 前導(dǎo)序列（L)-Pv.Pal2-l:l:l 的序列。
[0024] SEQ ID N0:7-pM0N100052CAS-Pv. Pal2//SUP-CCoAOMT//nos ;CAS-CaMV. 35S// npt2//nos 的序列。
[0025] 發(fā)明詳述
[0026] 本發(fā)明提供一種方法，所述方法用于選擇需要提高飼用價值的飼料作物。所述方 法的方面可應(yīng)用于多種飼料作物，例如，包括但不限于瑞士三葉草（Alsike clover)、紅豆 草（Sainfoin)、胡枝子（Lespedeza)、庫拉三葉草（Kura clover)、拉地諾三葉草（Ladino clover)、紅三葉草（Red clover)、白三葉草（white clover)、甜三葉草（sweet clover)、角 果百脈根（Birdsfoot trefoil)、鷹嘴紫云英（Cicer milkvetch)、小冠花（Crown Vetch)、 漢藜苜蓿（Medicago truncatula)和苜蓿（alfalfa)。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明的方法可以包括但不限于，選擇用重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因飼料 作物苜蓿植物的方法，所述重組DNA構(gòu)建體降低木質(zhì)素生物合成途徑中S-腺苷-L-甲硫氨 酸：咖啡?；?CoA 3-0甲基轉(zhuǎn)移酶（CCoAOMT或CC0MT)酶的表達或活性，所述方法使用與 不用所述重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的苜蓿植物相比酸性洗滌木質(zhì)素（ADL)降低、愈創(chuàng)木基木質(zhì) 素（G-木質(zhì)素）降低、中性洗滌纖維消化率（NDFD)升高以及活力至少大體上相當(dāng)或提高的 選擇標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明方法中的綜合選擇標(biāo)準(zhǔn)可選擇具有較高飼用價值的苜蓿植物。本發(fā)明涉 及與選擇并提高飼料作物營養(yǎng)相關(guān)的植物、植物部分、植物種子、植物細胞、農(nóng)產(chǎn)品和方法。
[0028] 本發(fā)明還提供一種包含啟動子分子的DNA分子，它在與對應(yīng)于SEQ ID NO: 1(SEQ ID N0:7的核苷酸6583-6882)的DNA片段或其互補片段連接的苜蓿植物細胞的維管組織 中起作用。本發(fā)明還提供一種包含SEQ ID NO 1的DNA分子（連接于SEQ ID NO 3,連接 于SEQ ID NO 2)，這個組合包含在SEQ ID NO:7的構(gòu)建體之內(nèi)）。在本發(fā)明的另一個方面 中是包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2的苜蓿植物細胞、植物部分、干草或種子。
[0029] 本發(fā)明涉及一種具有改善的經(jīng)濟學(xué)重要特性、更高飼用價值的轉(zhuǎn)基因植物。更具 體地講，本發(fā)明涉及一種包含本發(fā)明核苷酸序列、本發(fā)明的SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2并 且與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参锵啾蕊曈脙r值提高